上图展示今年以来CRISPR文库相关IF20的文章列表的1/4。这两年，CRISPR/CAS9火到让人习以为常。
利用其多方面的潜能，各种工具被开发出来，给科研工作者在生物体各个层面涂涂改改做研究提供了极大便利。简单列举如下表：
●DNA水平，可以实现精确基因编辑，大片段、单碱基都能hold住！
●RNA水平，转录调控RNA上下调，RNA干扰全都搞的定！
●表观遗传水平，调控DNA碱基甲基化不是梦！
●还有分子定位，基因检测(SHERLOCK)等等等等
更关键的是，这些工具不仅可以对单分子进行操作，更强大到可以在组学水平进行全面筛选——那就是CRISPR相关文库。
今天小编尝试由浅入深，跟大家聊聊CRISPR文库。
一首先，CRISPR/CAS9系统如何发挥作用？
第一步：引发双链DNA断裂（DSB）
简单来说，CRISPR/CAS9系统是蛋白-RNA复合体(RNP)，两者结合，一起发挥功能：
●sgRNA，通过与DNA碱基互补配对将RNP定位于基因组
●Cas9，核酸内切酶，切割DNA双链诱发DSB（红色箭头）
至此，CRISPR/CAS9系统的使命——瞄准了，切两刀，结束。
第二步：利用细胞DSB修复机制——编辑基因组
CRISPR/CAS9造成一个DSB，而真正帮助我们实现目的的，其实是细胞本身的DNA修复机制：
●无模板，非同源介导的基因编辑（NHEJ)，不精确，引发移码突变，实现基因敲除（KO，LossofFunction)
●有模板，同源介导的基因修复（HDR），精确编辑
一点点补充：
●有很多CRISPR系统只需要瞄准了，即精确结合到DNA（或RNA）上；
●不需要切两刀，即通过点突变将CAS9的2个核酸内切酶相关功能域失活；
●通过与CAS9融合表达另外一个功能蛋白（心有多大，舞台就有多大），实现其他功能，简单列举如下：
附：SAM/Sun-tag/CRISPRa
下面我们以CRISPR/CAS9本体用于基因功能研究为例接着聊。
二CRISPR/CAS9介导的基因敲除——强大的LossofFunction功能研究工具
说起Lossoffunction，必提RNA干扰。那么，比一比？
●RNA干扰残留目的基因仍旧可能维持其功能（图左）
●CRISPR/CAS9可将基因完全消除进而揭示其功能（图右）
三如何用这一强大工具进行组学层面的基因筛选呢？
先看流程
●如果CAS9和sgRNA通过两个载体导入细胞，那么需要就叫做“双载体”系统，看左边。
●如果CAS9和sgRNA通过一个载体导入细胞，那么需要就叫做“单载体”系统，看右边。
筛选原理？
主要原因是利用了慢病毒整合基因组的特性，以单载体文库说明：
一定用慢病毒？
除了整合的特性，慢病毒还有如下特点，让你不得不爱：
用RNAi文库也可以进行LossofFunction筛选啊？
那我们对比一下RNAi和CRISPR/CAS9如下：
针对同一基因多靶点表型一致性这一关键数据，来源是Science：
所以，CRISPR/CAS9可能更有优势哦~
做好CRISPR/CAS9文库筛选实验的关键是什么呢？
结合流程，细胞感染、药筛、收取细胞进行NGS都算是比较常规的操作，关键在：
CRISPR/CAS9文库过关！具体来说：
1.针对靶基因设计sgRNA科学合理。a.特异性要高，脱靶率要低，活性还要高。
b.尽量选择多个转录本的共有外显子。
2.单个基因要有多sgRNA对应。a.虽然张峰库靶点有效率平均高达80%（见下图），但还是需要多靶点设计保证针对每个基因都有有效靶点。
b.若基因敲除后有功能，多靶点可以互相印证，避免脱靶带来的假阳性
3.文库质粒构建和扩增必须经质检达标。像张锋的humanGECKO文库，大概有12万+条sgRNA，经过质粒构建、质粒扩增，必须经过NGS测序确保达到以下的高标准：
a.左图，高覆盖率。质粒扩增后经NGS，测到的sgRNA覆盖率要争取向“24K”的标准看齐——99.99%。
b.右图，高均一度。不同sgRNA靶点含量差距不能太大。
4.病毒包装在文库筛选过程中，我们期望除了药物，其他刺激的影响越小越好。所以病毒必须高滴度、高纯度、无污染：
更重要的是，慢病毒文库也必须有向24K看齐的高覆盖率和高均一度。下面是慢病毒感染细胞后抽取基因组NGS的慢病毒文库质检结果。
OK，经过两轮NGS测序，我才拿到了可以放心实验的CRISPR慢病毒文库。
前面虽然说简单说说，现在也还越发觉得不简单。反正我是觉得，如果让我自己做个慢病毒文库，简直跟读了半个博一样。
科研需要CRISPR慢病毒文库怎么办？
现在来说说我的老东家吧，下面是广告~
前面这些硬货干货，都是我在老东家耳濡目染接触到的，
数据也都是同事实打实一枪一枪、一盘一盘、一lane一lane做出来的，
为了做好CRISPR文库，
他们可谓是匆匆忙忙、没白没黑、试了又试，
最近看到他们躁动在周围蹦来跳去、时不时还亢奋的喊：
我们要成为国内CRISPR文库NO.1的专家！
不管是从头开始定制一个文库还是要张锋的现货文库，
不管是基因敲除文库还是SAM过表达文库，
不管是人、小鼠、大鼠还是猪牛羊、河豚或草泥马，
我们都肯定是速度最快、质量最好、性价比最高、服务最优！
看到他们的状态，我是信了。
