2细胞或病毒的驯化和筛选现代基因工程技术及个性化细胞培养基技术的发展,促进利用细胞培养技术进行生物制品的快速发展。寻求传代细胞系代替原代细胞培养或组织培养、改造细胞的特性、提高细胞的生产能力等将是现在和未来相当长的时期内的一个研究重点。本节主要就兽用生物制品用传代细胞系的适应驯化等做一简单的介绍。2.1常用细胞系悬浮培养常用细胞包括全悬浮培养用细胞和微载体悬浮培养用细胞。目前在工业中应用的主要有SP2/0、NS0、CHO、BHK和HEK细胞等,它们主要用于重组蛋白质生产;在兽用生物制品中常用的传代细胞主要有采用全悬浮培养的BHK21细胞、MDCK细胞;及借助微载体悬浮培养的Vero细胞、PK细胞、ST细胞、Marc细胞等,每种细胞的特性不同,对病毒的敏感性不同,下面对这些常用细胞系进行简单介绍。1)幼仓鼠肾细胞(babyhamsterkidney,BHK)
BHK细胞是幼年叙利亚地鼠肾细胞(BabyHamsterSyrianKidney)。年3月,I.A.Macpherson和M.G.P.Stoker从一日龄叙利亚地鼠肾分离建株,经过84天连续培养,获得单细胞克隆细胞,即clone13或C13。原始的BHK21细胞株为成纤维细胞,属于贴壁依赖性细胞,年Capstick等人实现了BHK细胞的悬浮培养后,使得动物细胞的工业化应用获得突破性进展。BHK细胞广泛用于增殖各种病毒,现已成为制备口蹄疫疫苗所需病毒抗原的理想的悬浮细胞培养系,之外还可用于生产狂犬疫苗等其它兽用疫苗。经研究证明,与其他哺乳动物细胞相比,BHK细胞在不同的环境下,其代谢类型具有较大的可调性及适应性。
2)Vero细胞Vero细胞是年建株,来自非洲绿猴肾,是一株转化细胞,呈成纤维细胞型,具有贴壁依赖性。Vero细胞较易持续培养,可支持多种病毒的增殖,是目前唯一一株获准生产人用疫苗的转化细胞,可用于生产人畜疫苗,如狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、流感病毒、传染性支气管炎病毒、小反刍动物瘟疫等多达10多种,是应用范围最广的细胞株。当前Vero细胞的悬浮培养中目前主要借助微载体(片状载体或是球状载体),具有良好的适应性,利用球状载体生产的规模化已达L规模。年,daelli等通过细胞适应驯化技术,使Vero细胞实现无血清悬浮化培养,该细胞系已被德国DMSZ中心收藏。
3)PK-15细胞
PK-15细胞是猪肾传代细胞系,其父母代源自年美国Stice提供的成年猪肾细胞PK-2a,后被美国ATCC收藏(收藏号为ATCC—CCL33)。该细胞具有贴壁依赖性,能分泌纤溶酶原活化因子和角蛋白。目前,PK-15细胞现已广泛应用于猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒(PPV)等的分离、体外增殖以及多种兽用疫苗的生产。4)ST细胞(Porcinetestis)ST细胞是猪睾丸细胞,体外培养呈贴壁生长状态,可进行连续传代培养。ST细胞在培养过程中增殖缓慢,细胞在传代过程中容易成团。该细胞对多种病毒比较敏感,如猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒等,生产中可应用于猪细小病毒、猪瘟病毒疫苗的制备。5)MDCK细胞(MadinDarbycaninekidney)MDCK细胞是犬肾细胞,年建株,来自成年雌性西班牙长耳狗,是一株转化细胞,具有贴壁依赖性,最初表现为成纤维细胞型,以后的克隆和传代后形成上皮型。MDCK细胞能支持多种病毒的增殖,多用于兽用疫苗的生产,如流感病毒疫苗、四联苗的生产。诺华公司年建立MDCK?悬浮细胞株,并建立悬浮化培养MDCK细胞生产流感病毒专用平台。6)Marc细胞Marc细胞为上皮样细胞,来源于猴肾细胞,从母细胞(MA细胞)克隆而得到,可进行连续培养。该细胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)较敏感,工业化中用于PRRSV的生产。上述是国内兽用生物制品制备常用细胞系,国际上早在上世纪末已开发出多种哺乳动物细胞系用来生产兽用生物制品,表2-1显示的是年前已开发的细胞系,并且均采用悬浮培养生产工艺进行生产,近些年在此基础上又开发出禽类悬浮细胞系AGE1.CR?用于生产流感病毒和安卡拉豆苗病毒(modifiedvacciniaAnkara,MVA)疫苗,MDCK生产流感疫苗及四联苗,PER.C6?和HEK-生产流感疫苗等。相比,国内兽用生物制品在产品种类及宿主细胞的选择上还有较大的提升空间。表2-1国外兽用生物制品及其宿主细胞
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