景杰编者按：皮肤是我们抵御外界损伤的第一道防线，皮肤的稳态与表皮祖细胞的功能及其增殖、定位、分化等过程密切相关。一旦表皮（祖细胞）分化出现异常，将会导致各种皮肤疾病甚至是皮肤癌的恶果（如鳞状细胞癌SCC）。目前对于表皮分化的研究主要集中在形态发展和转录水平的变化上，而很少有针对细胞信号通路调控，尤其是蛋白质磷酸化信号通路的报道。目前发表在国际著名期刊EMBOJournal上的研究成果填补了这一空白，文章对表皮祖细胞分化前后的磷酸化修饰水平进行了定量比较。结果发现修饰水平变化最显著的是与细胞黏着相关的桥粒蛋白（desmosomeproteins），其中桥粒蛋白PKP的磷酸化水平又受激酶RIPK4的调控，且在细胞分化后显著上调。更为重要的是，细胞和动物模型实验表明，Pkp或Ripk4的缺失都会破坏表皮正常分化，诱发表皮癌变。景杰生物作为全球蛋白质及翻译后修饰的领跑者，可以为您提供一整套常规蛋白质组学及修饰组学研究的解决方案，同时还能为您提供高灵敏度的修饰类泛抗体，助力您的研究工作。
研究思路和成果：文章结合SILAC标记和高通量质谱技术对表皮祖细胞分化前后的磷酸化组学进行了分析，共鉴定到了~个磷酸化修饰位点，这些位点分布于~个蛋白上。功能注释发现，细胞分化前后磷酸化水平显著改变的蛋白与细胞膜/细胞连接/细胞黏着相关，还与表皮发育、细胞骨架重塑等过程相关。值得一提的是，改变非常明显的是与细胞连接/黏着有关的桥粒蛋白，其中Pkp(plakophilin-)的磷酸化水平在细胞分化后上调最为显著。先前的研究显示，Pkp介导了桥粒钙黏着蛋白、桥粒斑蛋白与角蛋白之间的互作，Pkp功能缺失突变（Loss-of-functionmutation）会导致人类外胚层发育不良/皮肤脆性等病症；而在Pkp敲除模型中，小鼠的皮肤细胞连接出现了严重问题。结合磷酸化组学的数据，研究人员分析Pkp的功能及其磷酸化水平很可能与表皮细胞的分化和稳态密切相关。为了验证这一假设，他们构建了基因编辑CRISPR-Cas9系统，在小鼠的表皮祖细胞中稳定敲除Pkp。表皮分化的标志物Keratin0（角蛋白0）和loricrin（兜甲蛋白）的表达水平在Pkp缺失的细胞中显著下调。而将敲除了Pkp的表皮细胞移植到裸鼠上会生成显著加厚的表皮层，同时桥粒和细胞紧密连接的标志物在Pkp敲除的表皮组织中均表现出异常分布。表皮分化异常是鳞状细胞癌(SCC)的一个显著特点。研究人员发现SCC细胞中Pkp的基因表达水平明显下调，而小鼠表皮成瘤实验发现Pkp的缺失不仅会导致细胞分化标志物的表达异常，更严重的是促进表皮癌变的进程并形成更大更具侵袭性的肿瘤，产生溃疡和坏死，这也与皮肤鳞状细胞癌的特征一致。修饰组学的数据表明Pkp的N端有三个丝氨酸位点的磷酸化水平在细胞分化后显著上调，在Pkp基因敲除的细胞中转入野生型和这三个位点的组成型磷酸化突变体（StoE,phosphomimeticmutant）可以回补细胞分化的缺陷，而磷酸化缺陷型突变体（StoA）无法回补细胞分化的缺陷，证明Pkp的磷酸化水平对表皮细胞的正常分化至关重要。为了寻找调控Pkp磷酸化的激酶，研究人员建立了一个涵盖个激酶的文库（kinomelibrary），将每一个激酶分别与Pkp野生型或Pkp的N端磷酸化缺陷型突变体（SAmutant）共转染细胞后进行磷酸化水平检测，发现RIPK4能够针对性的调控Pkp的N端磷酸化，体外激酶试验也验证了这一发现。为了研究RIPK4与表皮分化和皮肤癌变的相关性，研究人员构建了RIPK4条件敲除小鼠模型（cKO），cKO小鼠的表皮层加厚、分化异常，并且会自发癌变。更为重要的是，RIPK4敲除细胞的分化异常表型能够被Pkp的组成型磷酸化突变体（SEmutant）所挽救（而不能被野生型Pkp和缺失型磷酸化突变体SAmutant挽救），说明RIPK4调节表皮细胞分化这一过程是通过磷酸化Pkp来实现的。获知Pkp上游的调控机制，那么下一个问题必然是其下游的分子机制是什么。已有的报道显示，桥粒的钙黏着蛋白DSG可以与Erbin（Erbb2结合蛋白）互作，继而破坏Ras-Raf脚手架蛋白SHOC2的功能，从而抑制ERK（MAPK）信号通路。Ras-Raf和MAKP信号通路与表皮的稳态密切相关，同时在本研究中，DSG的分布在Pkp缺失的皮肤中出现异常。由此研究人员猜测，Pkp的功能可能通过Erbin-SHOC2-MAPK这一信号轴实现。生化实验发现，敲除Pkp或引入其SA突变体都会使Erk的磷酸化水平显著上调，而WT和SE突变体会使Erk的磷酸化水平下调。WTPkp和SEPkp可以与SHOC2结合，而SA突变体的却不可以。这些结果暗示Pkp的N端被磷酸化修饰后会促进其与SHOC2的结合，从而抑制Ras/MAKP信号的传递，导致细胞分化。总结：综上所述，研究人员通过磷酸化修饰组学发现，与细胞黏着/连接相关的桥粒蛋白Pkp的磷酸化水平在表皮祖细胞分化前后显著改变。激酶文库筛选证实激酶RIPK4能够调控Pkp的磷酸化。Pkp和RIP4的正常表达对表皮细胞分化十分重要，而缺失了由RIPK4调控的Pkp磷酸化会严重影响表皮细胞的分化，甚至引发皮肤癌变。磷酸化的Pkp能够结合下游Ras/Raf信号通路蛋白SHOC2，抑制Erk（MAPK）信号，从而引发细胞分化。这一结合高通量修饰组学、激酶文库、体内体外功能实验的研究为探索器官组织分化的分子机制和寻找相应癌症的潜在药物靶点提供了重要的思路和手段。参考文献：
Leeetal.,PhosphorylationofPkpbyRIPK4regulatesepidermaldifferentiationandskintumorigenesis.EMBOJ.May5.
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