肿瘤耐药研究之信号通路实验方法大集合！
《二十四型》的上期课程初步涉及了由细胞自噬和PI3K/AKT介导的肿瘤耐药通路，而本期肿瘤耐药表型（下）将继续讲解肿瘤耐药相关的其他信号通路以及相关研究实验方法。
肿瘤耐药的信号通路
1.NF-κB信号通路
该通路主要有三个重要分子：NF-κB、IκB以及IKK。通常IκB可与NF-κB结合形成二聚体，起到负调控作用；当有外界刺激激活IKK后，可降解IκB释放NF-κB，NF-κB转运至核内后与下游靶基因的κB位点特异性地结合，可促进目的基因的转录表达。
NF-κB通路在很多情况下都是PI3K-AKT通路下游的效应通路。活化的PI3K-AKT可激活NF-κB，上调MDR1基因和它的蛋白产物P-gp的表达，进而导致细胞耐药。NF-κB还能通过上调Bcl-xl等凋亡相关基因的表达，和P-gp蛋白一起发挥协同效应，共同诱导肿瘤耐药现象的发生。
2.MAPK信号通路
1）ERK通路介导的肿瘤耐药
生长因子，如表皮生长因子（EGF）或成纤维生长因子（FGF），通过受体酪氨酸激酶激活下游的Ras，然后通过Ras-Raf-MEK-ERK信号通路来激活ERK1/2；而转移至核内的ERK可通过调控MDR1基因以及上调P-gp蛋白的表达来介导肿瘤耐药。
2）JNK通路介导的肿瘤耐药
有些细胞外刺激可以激活JNK，进而激活核内转录因子c-Jun，而后通过调控MDR1和MRP基因的表达来参与调控肿瘤细胞的耐药表型。
但是JNK/c-Jun通路除了能诱导细胞发生耐药，也能抑制细胞发生耐药，其可能的原因是JNK/c-Jun通路在不同的细胞内可介导不同下游靶基因的转录。
3.HIF-1信号通路
当肿瘤细胞处于严重的缺氧微环境时，也容易产生化疗耐受性。这是因为细胞内的缺氧诱导因子HIF-1α可对多个肿瘤多药耐药相关基因进行调控，这些基因包括MDR1（上调蛋白P-gp的转录水平）、ABC超家族（上调MRP1、GST-π的表达）和血红素加氧酶（HO-1，介导应激反应抵御化疗效果）。
4.表观遗传学修饰介导的肿瘤耐药
表观遗传学机制虽然不涉及DNA序列的变化，但是却涵盖了DNA的甲基化、组蛋白的修饰等多个层次的基因调控网络变化。目前的研究证实，MDR-1基因启动子区域的DNA低甲基化状态是介导耐药的重要机制之一。
另外，某些抑癌基因（如hMLH1和RASSF1A）由于表观遗传学修饰的机制导致表达下调或者表达受到抑制；或者某些和肿瘤增殖/存活相关的癌基因也可以由于表观遗传学的修饰而获得表达上调，这些因素共同作用从而导致肿瘤细胞发生耐药。
肿瘤耐药的研究方法
1.肿瘤多药耐药细胞株的构建
1）药物浓度递增法
该法又称为逐步诱导法、低浓度加量持续诱导法、小剂量间歇诱导法，是建立多药耐药细胞株最有效、最常用的方法，所建立的耐药细胞株耐药性稳定、可靠，耐药倍数普遍高于其他方式建立的耐药细胞株。但缺点是耐药株建立时间较长，细胞耐药性与培养时间成正比。
一般是首先选用低于某种化疗药半数抑制率（IC50）的药物浓度对细胞进行首次诱导，之后逐渐加大剂量直至细胞在较高浓度下可正常生长。
2）药物大剂量冲击法
该法又称为大剂量间歇诱导法、高浓度短时间接触培养法。此法一般选用数十或数百倍于IC50的药物，培养1~2h后立即更换不含药物的培养基间歇培养，待细胞生长至对数生长期再重复剂量冲击。
此类方法建立的多药耐药细胞株的耐药倍数较低，培养时间优势并不显著。
3）大剂量冲击结合浓度递增法
该法是药物浓度递增法和药物大剂量冲击法结合使用的方法，可先对敏感细胞短期孵育大剂量化疗药，也可先对敏感细胞长期孵育较低浓度的化疗药，之后两种方式交替进行，同时伴随着低浓度化疗药物的剂量逐渐升高。
此类方法建立的耐药株一般比大剂量冲击法建立的耐药细胞株的耐药倍数高且稳定性好，但操作更为复杂，在培养时间方面没有太多优势。
4）转基因结合药物筛选法
基因转染主要通过脂质体或逆转录病毒载体向亲本敏感细胞株中转染多药耐药蛋白，基因转染后需要进行药物筛选以确保其转染表达的外排蛋白具有活性。
该法建立的耐药细胞株具有耗时短、耐药强度高且稳定等特点，是近年来新兴的耐药细胞株建立方法。但由于耐药基因在细胞内的过量表达，可导致细胞内基因表达网络的巨大变异，会给耐药细胞株的筛选以及相关的机制研究带来巨大的干扰。
2.肿瘤多药耐药动物模型的构建
在体动物模型能更好地反映体内肿瘤耐药现象的形成情况，而目前多药耐药体内模型分为移植型和诱导型两种，最常用的实验动物是小鼠和大鼠。
1）移植型肿瘤MDR动物模型
此模型是直接将耐药细胞株或肿瘤组织接种到动物体内的方法，具有实验周期短、成瘤率高、操作简单易行、肿瘤位于浅表方便观察、耐药性较稳定、个体差异较小等优点；其缺点是用于移植的耐药株耐药指数越高，在动物体内的致瘤率越低。
2）诱导型肿瘤MDR动物模型
这种方法是仿照人体多药耐药的形成过程来建立耐药的动物模型，弥补了由于化疗药物作用的影响因素过于复杂而无法获取相对一致的模型的劣势。但该模型的肿瘤细胞耐药倍数不高，并不适合建立要求耐药倍数高的动物模型。
3.模型的评价方法
肿瘤耐药模型建立后，需要评估模型建立是否成功，其相关评价方法一般包括以下三种。
1）耐药倍数的检测
用一种化疗药物培养建立的多药耐药细胞株，一般需要选取同种、同类及不同类型的其他化疗药物检测细胞的敏感性，用以衡量细胞多药耐药的特性。耐药性一般采用耐药倍数表示，实验常用MTT法进行检测。
2）耐药标志物的检测
耐药标志物包括多药耐药蛋白及其他标志性恶性功能分子，如P-gp、多药耐药相关蛋白-1（MRP1）、肺耐药相关蛋白（LRP）、乳腺癌耐药相关蛋白（BCRP）、拓扑异构酶II（TOPOII）、谷胱甘肽转移酶-π（GST-π）、基质金属蛋白酶（MMP）等。
检测手段主要涉及荧光法检测外排蛋白底物累积，PCR法检测功能分子基因表达，免疫印迹法、流式细胞术检测蛋白表达等。
3）耐药机制的检测
常见的肿瘤多药耐药机制包括以下几种：①耐药相关蛋白高表达；②影响药物代谢；③影响药物作用的靶点；④细胞凋亡受到抑制；⑤介导肿瘤耐药的明星信号通路。
此外，肿瘤多药耐药的产生可能与DNA修复、蛋白激酶C、微管蛋白相关蛋白、体内激素、肿瘤血管形成以及线粒体凋亡等多种因素有关。
4.研究耐药的高通量研究方法
课程中主要介绍了以代谢组学为代表的高通量筛选方法。虽然目前代谢组学仍存在诸多的不足和缺点，比如研究手段的局限性，不同个体间代谢产物受食物和环境影响较大等。但随着检测和分析技术的不断进步和发展，代谢组学在肿瘤耐药领域中的应用研究也越来越广泛，在个体化用药指导以及肿瘤耐药性监测中的应用越来越广泛。
往期《二十四型》课程内容：
1.老谈登场《二十四型》，带你领悟表型常识套路
2.细胞周期——控制细胞命运的隐形时钟
3.细胞凋亡：优雅的落幕
4.第四型，血管新生
5.老谈深度解读自噬，梳理诺奖级科研热点
6.肿瘤耐药表型的关键分子与信号通路
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