我们在做细胞转染实验时，有一大部分童鞋是要做细胞的稳定转染的，比如需要拿到某个基因的稳定细胞系，以便长期研究这个基因的功能；又比如为了大量表达某个蛋白，需要建立稳定细胞系，以便建立一个长期稳定表达蛋白的细胞株，总而言之，细胞稳转是最常见的实验之一，也是我们今后投身研发工作后最常用的实验之一，有这一技傍身，往往能使你的简历在药物研发公司的招聘中脱颖而出，believeme！
言归正传，我们曾在介绍转染的第一期就提到过瞬时转染和稳定转染的区别，这期将不累述。稳定转染实验一般都采用含有选择标记物(如抗生素抗性基因)的质粒进行瞬时转染，从中筛选出稳定转染的细胞。应使用不含选择标记物的DNA转染细胞，作为阴性对照。
抗生素在稳定转染中起到了很重要的作用，很多人都是看别人使用什么抗生素，他就跟着使用什么抗生素，其作用机制也不清楚，但其实抗生素的选择也是很有讲究的，下面我们就来介绍几款在真核细胞中常用的选择性抗生素。
Geneticin选择性抗生素?
GeneticinR试剂又称为G硫酸盐，被广泛应用于筛选哺乳动物、植物或酵母细胞，也是稳转筛选的金标准。常用的浓度从mg/ml到2mg/ml不等，一般在10-14天就能筛选出稳定的克隆细胞。
Zeocin?选择性抗生素
Zeocin?试剂对哺乳动物细胞系、酵母、昆虫细胞和细菌有效。Shble基因可使细胞获得对Zeocin?试剂的抗性，防止表达蛋白质的细胞中结合Zeocin?试剂并出现细胞DNA剪切。用于筛选时的浓度范围为50至2,μg/mL(一般为μg/mL)，具体浓度取决于细胞类型。
潮霉素B选择性抗生素
潮霉素B是一种氨基糖苷类抗生素，可干扰80S核糖体的易位并导致误译，从而抑制蛋白质的合成。由于其作用方式与GeneticinR或Zeocin?试剂不同，因此可用于双重筛选实验。大肠杆菌潮霉素抗性基因(hyg或hph)会使细胞产生潮霉素B抗性。用于筛选时的浓度范围为至1,μg/mL(一般为μg/mL)，使用时应依据各细胞系进行优化。
二盐酸嘌呤霉素选择性抗生素
嘌呤霉素是从白黑链霉菌中分离的核苷类抗生素，它是一种翻译抑制剂，对原核细胞和真核细胞均有效。链霉菌中的嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶(pac)基因使细胞获得抗性。嘌呤霉素作用迅速，低抗生素浓度时即可导致细胞迅速死亡，在不到一周的时间里即可生成稳定的抗嘌呤霉素细胞系。其浓度为2–5μg/mL时对贴壁的哺乳动物细胞有效，而浓度低至05–2μg/mL时即可对悬浮细胞有效。
杀稻瘟菌素S盐酸盐选择性抗生素
杀稻瘟菌素是从灰色产色链霉素中提取的核苷类抗生素，它是一种强效翻译抑制剂，对原核细胞和真核细胞均有效。土曲霉的bsd基因产物会使细胞产生抗性。该试剂通常在浓度达50μg/mL时对大肠杆菌有效，而浓度低至2–10μg/mL时即可对哺乳动物细胞有效。对杀稻瘟菌素敏感的细胞会迅速死亡，只需较低的抗生素浓度，在不到一周的时间里即可获得稳定的抗杀稻瘟菌素哺乳动物细胞系。
接下来，我们再介绍以下稳定转染的一般流程
开始前，我们需要确定以下几个要素
确保您使用的细胞系可以从分离细胞生长出集落，因为一些细胞需要相互接触方能生长。对于这些细胞，可以使用适应或条件培养基。
选择适当的选择标记物(文中已介绍)。
根据您的细胞类型选择适当的转染步骤（参照本系列第二期内容）。
建立剂量反应曲线(杀死曲线)，确定您的细胞类型的筛选条件。
杀死曲线对于稳定转染阳性克隆筛选至关重要，大家千万不能因为一时手懒，跳过这一步，尤其是刚开始做细胞稳转实验的童鞋。
杀死曲线（KillingCurve）应根据每种细胞类型，以及在每次使用新批次的选择性抗生素时建立杀死曲线，原则上：
1以大约1:5至1:10的比例(取决于细胞类型和转染后的细胞密度)将汇合细胞分种至含有不同浓度的抗生素的培养基中。
2孵育细胞10天，每4天(或根据需要)更换一次选择培养基。
3采用适当的方法(如自动细胞计数仪、血球计数器及台盼蓝染液)观察培养皿中的活细胞。
4绘制活细胞数与抗生素浓度图，建立杀死曲线，确定杀死未转染细胞所需的最适当的选择性药物浓度。
确定加抗生素时间和维持浓度
1由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早;但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G筛选。随着细胞的代谢,G的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G的筛选液。这时药物浓度可以降至ug/ml。
2加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。3.关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应不断提高其浓度。而且，如果你要挑选到几个阳性克隆中较高表达的克隆的话，可以调整抗生素的浓度。当然，抗性基因高表达，目的基因不一定就跟着高表达。
开始实验时，我们可以选择合适的工作流程：
1采用适当的转染方法转染细胞。如果是在单独的载体中加入选择标记物，则使用含有目的基因的质粒与含有选择标记物的质粒的摩尔比为5:1至10:1。
注：使用含有选择标记物但不含目的基因的载体进行对照转染。如果从转染有对照质粒的细胞中获得集落，但未从转染含有目的基因的质粒中获得，则表示目的基因可能有毒。万一转染失败或培养物被污染，应重新转染。
2转染四十八小时后，以不同的稀释度(如1:、1:)传代细胞至含有适当选择性药物的培养基中。由于处于汇合、非生长状态的细胞对GeneticinR等抗生素具有抗性，因此要实现高效筛选，应使细胞处于半汇合状态。悬浮细胞单克隆可在软琼脂或96孔板中筛选。
3随后的两周，每3至4天(或根据需要)更换一次含有药物的培养基。
注：高密度的悬浮细胞培养物会耗尽重要的可溶性生长因子，从而降低细胞活性和系统的效率，因此需要频繁更换培养基。
4在第二周，监测存活的“岛状”细胞。根据细胞类型的不同，具有抗药性的克隆可在2–5周内出现。转染阴性对照质粒的培养物应在3–9天后出现细胞死亡。
5使用克隆环或无菌枪头分离较大的健康集落(–1,个细胞)，继续在含有适当药物的培养基中培养。
6将具有抗药性的集落中的单细胞转移至96孔板内，确认它们可以生长出抗生素抗性集落。确保转移后每孔只含一个细胞。
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本文部分内容选自《转染知识基础手册》
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