CRISPR/Cas9系统作为细菌和古细菌的获得性免疫系统，通过RNA介导特异性的切割外源遗传物质，用以对抗入侵的病毒和质粒。利用Cas9来摧毁入侵DNA的TypeⅡCRISPR/Cas系统，可以在体外进行基因的编辑。
为了提高CRISPR/Cas9的特异性，使用Cas9切口酶和一对sgRNA，两个相近的切口造成DNA双链断裂，诱导细胞发生非同源末端连接修复，造成目的基因的突变。
利用CRISPR/Cas9进行基因的编辑，首先要构建有效的sgRNA。一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（ProtospacerAdjacentMotif）前间区序列邻近基序。这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割的20个nt。而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）
01
找敲除目的基因的外显子
根据目的基因选择待敲除靶基因位点找出敲除目的基因的外显子。首先在第一个起始密码子ATG之后的外显子中找出特异性高的上下游序列。以小鼠基因Th为例。在pubmed上找到基因的mRNA的CDS区，选择第二个外显子作为敲除位点。
02
设计成对sgRNA序列
