生物样本库BS小组
目前细胞的长期冷冻保存通常需要使用液氮（LN2），因为常用冷冻保存介质是含有细胞膜渗透性的冷冻保护剂，它们在较高贮存温度如-80℃下冷冻时具有热不稳定性。这种不稳定性导致冰的再次结晶，这就使得大多实验室在冰柜条件下保存的细胞，其存活率随着时间的推移而逐渐丧失。依赖液氮贮存细胞明显增加了运营成本并提出了工作效率削弱和安全相关的问题。我们证明在实验室冰柜工作温度为-80℃的情况下，向冷冻保护剂溶液中添加Ficoll70可以显著提高体系的热稳定性。此外，培养基中含有Ficoll70和DMSO或者缺少FBS可以对人和猪的多能干细胞在-80℃下提供更可靠的低温贮存，并且保存周期至少可以持续一年，而且可以确保解冻后的存活率，植板率和多能干表型的完整保留可以与液氮环境的贮存相媲美。这些结果说明长期冷冻保存方法的可行性，可完全消除对液氮的需求。
多功能干细胞有自我更新的能力，也可以诱导分化成类型广泛的细胞。第一特性意味着此类细胞可以提供近乎无限的未分化细胞储备，冷冻贮存以供将来使用。第二特性是多功能干细胞可以被诱导分化为广泛的成熟细胞类型，它能提供一个独特的资源用于研究基础发展过程以及作为更换和修复组织的细胞来源，这在很大程度上尚未开发潜能[1,2]。保持干细胞系的质量受控制的干性能力以及在不同地理位置之间安全方便且以合理成本空运冷冻保存的干细胞是小型和大型实验室操作的重要挑战[3,4]。
多能干细胞主要有两种类型，虽然每一个可以转换成另一个[5-7]。首先，以来源于老鼠的为例，所谓的“原始态”型，它依赖白血病抑制因子（LIF）和STAT3生长信号。第二，以人类、猴子和猪为典型，经常被称为外胚层型，需要FGF2来实现自我更新和保持多能性。然而原始态类型的细胞形成半球形克隆，可以很容易地分散成单细胞传代和冻存，后一种类型则形成扁平，有粘附性的克隆，当细胞互相分离时则失去活性，除非采取特殊的预防措施[8,9]。因此，外胚层型干细胞传代和冻存历来为团块。然而，冻存团块有局限性，因为冷冻保护剂可能渗透细胞团块不佳，以至于冻存后只有一小部分细胞能存活。植板率通常很低并且克隆繁殖困难[10-12]。最近，研究显示可以在冻存之前和解冻之后添加RHO激酶(ROCK)抑制剂来提高人类胚胎干细胞（ESC）冷冻保存效率和随后的克隆生长[13-17]。
在冷冻保存方面有两个方法被广泛使用：稳态（慢速冻存）和非稳态（玻璃化）冷冻程序。玻璃化法和它的“慢玻璃化”变异法，不仅阐明了由于使用高浓度（通常40-50%v/v）渗透保护剂导致的细胞渗透损伤和毒性，而且要求液氮或其他低温液体获得和维持低温下细胞内和细胞外溶液的玻璃化，例如在一个大气压下液氮的饱和温度（-℃）或气相液氮（通常-℃）。缓慢冷冻，细胞满载一个低浓度（通常10%v/v）的冷冻保护剂，然后缓慢冷却到一个中间温度，例如在-80℃的冰柜中[20]。在冷冻过程中，冰沉淀逐渐使溶质的浓度增加，以至，达到中间温度之后，包含细胞的残液变得高度浓缩并呈现粘稠液态[21]。细胞外的冰在这样部分冻结的体系中是不稳定的，在冷冻过程中自发形成的小冰晶开始融合形成大冰晶以减少表面的能量[22,23]。这个所谓的再结晶现象可以引起细胞机械损伤也导致致命的细胞内冰的形成[21,24]。尽管这个过程非常慢（通常发生超过几周而不是几个小时），但它是渐进的，甚至在低至-80℃的温度下[25-29]。因此，很有必要有第二步冷却，即从-80℃到低温。
然而，无论是工业还是大型实验室的规模，使用液氮长期贮存细胞，通常需要低温冷藏柜，高压液氮罐和程控液氮冷却机，它们的购买和维护费用昂贵。此外，较小规模的，尤其是使用液氮杜瓦瓶的贮存，依赖于液氮的持续供给。部署液氮也增加了很多安全和维护问题，并且在经济方面也给用户造成负担。工作温度通常在-80℃的机械冷藏柜在多方面可以替代液氮，例如保存微生物和病毒[30]，贮存人类组织[31]，并且只要冷藏储藏柜配有备用电源、温度监控和报警系统就能良好运行。然而，尽管有这些附加装备，低温冷藏柜与液氮相比依然有可能在许多应用方面显著改善运营成本效率。一旦证明-80℃的低温贮存是成功的，不仅可消除液氮使用相关的安全问题，即冷灼伤、液氮罐爆炸和操作者窒息，而且也避免了储存罐例行的加注需要，较大规模的生物样本库需要更低成本的设施和设备并使用更简单的操作程序。因此，人们正在努力使用机械冷藏柜来长期低温贮存细胞系。在某些情况下，例如红细胞和外周血造血干细胞，已证明这些努力是比较成功的，可能是因为特殊的生物物理性质，例如流变学，细胞类型的属性使得它们在贮存过程中历经冰的再结晶的负面作用后还能存活[32-35]。然而，其他细胞类型，包括胚胎干细胞，在经历-80℃冻存之后失去生存活性并且呈现出特性的改变，因此仍然是需要液氮[25-29]。生物防冻复合物，尤其抗冻蛋白和抗冻糖蛋白，通过促进热滞后、抑制冰的再结晶以及可能改善膜结构的完整性[36-38]等在冷冻保存方面有潜在的价值，但是有益和有害影响的结果喜忧参半，由于这些复合物的商业用途有限使其应用受到阻碍。各种肽和糖肽衍生物的生物抗冻复合物、合成聚合物和非肽或聚合物为基础的小分子，已经被证明是有效的冰再结晶抑制剂(IRI)[39,40]。获得认同的细胞冻存方法是要在低浓度的冰再结晶抑制剂（根据IRI类型）下，并且对某些种类的细胞不使用渗透性细胞冷冻保护剂，包括人和羊血红细胞[39]，人胚胎干细胞[40]，大鼠间充质干细胞[41,42]，来自人脐带血的单核细胞[43]等等。利用冰再结晶抑制剂的细胞冻存方法成为一项很有前途的技术，因为他们排除或减少了对渗透性冷冻保护剂的需求，但在很大程度上，他们仍然依赖液氮贮存。人红细胞已被成功地贮存在-80℃、含有低浓度合成的小分子IRI和低浓度甘油（15%）[44,45]的介质环境中。这个方法具有减轻温度波动影响的另一的优势。然而，据我们所知，IRI的使用除人红细胞冻存在-80℃外并没有延伸到细胞的冷冻保存中。为了克服这个缺点，我们为标准实验室冰柜开发了一种在特定运行温度下长期贮存多功能干细胞的方法，即通过使用一种常用的多聚糖Ficoll70。
研究结果
差示扫描量热法分析包含和不含Ficoll70的冷冻保护剂溶液的热稳定性。为建立缓慢冷冻过程结束时，冷冻保护剂溶液残留非冷冻部分的模型，制备高浓缩的三份溶液。通过使用差示扫描量热法，记录这些被预冷到-℃的玻璃化溶液在升温过程中的放热曲线（见图1，三个例子）。用这种方式测试的模型溶液组成有一种典型的渗透性冷冻保护剂DMSO和一种非渗透性溶液，即Ficoll70，Ficoll，PVP40，PVP和蔗糖（表1）。在所有情况下，溶质总浓度固定为50%。就Ficoll，PVP和蔗糖而言，溶液包括同等重量比的DMSO和非渗透性溶质，如每个浓度为25%w/v。其他两个被测模型溶液是50%的DMSO以及33.3%DMSO和16.7%Ficoll70的混合物（表1；图1）证明了Ficoll70浓度的影响。通过测量去玻璃化温度（Td）来评估每一个溶液的热稳定性，如图1所示。正如表1显示，Ficoll70与等重量的DMSO（25%Ficoll70/25%DMSO）比其他任何等量的DMSO溶质提供更高的Td，并且表现的更好，例如比16.7%Ficoll70/33%DMSO和50%DMSO模型溶液有显著升高的Td（图1）。25%Ficoll70/25%DMSO冷冻保护剂溶液提高Td值到-67℃，这远高于普通实验室冰柜的贮存温度。因为再结晶温度总是高于Td，我们假定重量比大致相同的Ficoll70和DMSO在他们慢慢冷却然后保持在-80度或干冰中时有潜力稳定DMSO水溶液。
图1.水-Ficoll70-DMSO模型溶液有不同质量比的Ficoll70与DMSO及相同溶质比50%（W/W）的DMSO在升温过程中的差示扫描量热分析示例。标记了这些模型溶液的特征温度转换：玻璃化温度（Tg），去玻璃化温度（Td）和熔点（Tm）。提供10mW的标尺来评估每个相转换时巨大的热流。
溶质浓度(w/w)
去玻离化温度Td
25%Ficoll70,25%DMSO
?67.0°C
25%Ficoll,25%DMSO
?75.7°C
25%PVP40,25%DMSO
?91.5°C
25%PVP,25%DMSO
?.8°C
25%sucrose,25%DMSO
?.1°C
50%DMSO
?.2°C
16.7%Ficoll70,33.3%DMSO
?90.6°C
表1.在缓慢冷冻过程结束时，残留非冷冻部分浓溶液模型的去玻璃化温度（Td）。溶液中含有一种聚合物（或蔗糖）及DMSO。每种溶液总溶质质量百分比固定在50%。
原生态O2K猪诱导多能干细胞（iPSC）在不同浓度Ficoll70介质中长期冷冻保存后复苏的评估。原始态猪IPSC细胞克隆（O2K猪的IPSC）[46]用商业化的蛋白酶，Accutase?分散。培养介质基于胎牛血清FBS或Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，无血清），在培养液中逐滴加入悬浮细胞后，使终浓度为10%DMSO，另外分别0%，5%，10%或15%Ficoll70。缓慢冷冻到-80℃后，小瓶贮存在-80℃两周。对照组不含Ficoll，同样被缓慢冻存然后存放于-80℃（作为阴性对照）或放液氮中（作为阳性对照）。解冻之后，只提供了贮存在-80℃含有10%Ficoll70的细胞与液氮中的对照相比的植板效率（图2）。低浓度（5%）和高浓度（15%）Ficoll环境中细胞存活率相当差，所以10%的浓度被用于随后的实验中。重要的是，缺少FBS似乎没有对低温保存产生负面影响。
图2.，在含有FBS（A）或者无血清DMEM/F12冻存液中使用不同浓度的Ficoll70，原始态O2K猪iPSC复苏的评估。从而确定Ficoll最佳组成。数据是使用冻存2周的细胞。每个图标尺是平均值±SEM（n=3），使用不同字母（a-c）标注显著性差异（p＜0.05）。冻存前的细胞悬液样本中含10%DMSO，不同浓度的Ficoll70（5%，10%或15%）冻存于-80℃。含10%DMSO而不含Ficoll的样本冻存于液氮和-80℃冰柜中作为两个对照组。
用Ficoll70长期冷冻保存原始态O2K猪iPSC后细胞复苏的评估。一旦Ficoll70在冻存中的最佳浓度被确定，就可在更长时间段检测冻存效率。每实验组样本在2，5，10和58周后被解冻。即使是2周，在-80℃低温冻存中不含Ficoll的细胞吸附和扩散的能力与其他两个实验组相比严重下降（图3A）。这些下降随贮存时间的延长呈渐进趋势，以至于10周的细胞复苏率很低，且贮存了58周的细胞没有克隆形成（图3A）。相比之下，冻存在-80℃且含有Ficoll介质的细胞在克隆数量（植板效率）和扩增能力（细胞数量）方面与冻存在液氮中的细胞相比没有明显下降（图3A）。这些原始态猪细胞中多潜能标记物NANOG,POU5F1,SOX2和SSEA1的表达都没有受冷冻保存的影响（图4A）。
猪的外胚层iPSC，H1型人的ESC和人的iPSC分离成小细胞团的细胞复苏的评估。在起初的外胚层细胞试验中，ID6猪的IPSC[47]细胞克隆在酶的处理后用切割工具（图5A,B）将其分成大块（~细胞）,这是传代细胞的传统方法。与原始态细胞相比，这类贮存在-80度且含有Ficoll介质的细胞（图6C）与贮存在-80℃或液氮中但不含有Ficoll70介质的细胞（图6A,B）相比明显更少、更小。换句话说，当大细胞块被冻存的时候Ficoll的存在呈现负面影响。在下一个试验中，ID6猪的iPSC在冻存前使用温和的细胞分离试剂（干细胞技术）将细胞分散成小细胞而不是破解成大细胞块（图5C）。样本在冻存5周和15周后解冻。正如观察之前描述的猪原始态细胞（图3A），外胚层型的ID6猪iPSC在10%的Ficoll中-80℃冻存，15周后发现与液氮中冻存的每孔数量相近（图3B左）克隆大小相近（图3B右），冻存效率没有下降（图3B）。Ficoll70对人的ESC（H1细胞）也可以提供有效的冻存，细胞使用温和的细胞分离试剂消化成小块（图3C左）。然而，从含有Ficoll-80℃冻存的细胞复苏后的克隆大小比液氮组小（图3C右），尽管克隆数量相同。另一方面，冻存在-80℃含Ficoll的65周后大量人的IPSC细胞被使用时，植板效率和克隆大小与液氮对照组没有不同（图3D）。
多能性标记物（ID6猪iPSC的POU5F1，SOX2和SSEA1；H1细胞的NANOG，POU5F1，SOX2,和SSEA4）在解冻后再培养继续表达（图4C）。另外，解冻的H1ESC可能形成拟胚体，包含多种滋养层细胞分化特征和三个种系（图4D）。解冻后的H1细胞可能驱使分化成自然收缩的心肌细胞表达TNNT2—心肌的一种标记物（图4E和附加录像1）。
完全分散的H1人胚胎干细胞（ESC）的冻存。我们接下来用TrypLE分散含有RHO酶抑制剂的H1细胞群落来获得悬浮的单个细胞（图5D），冻存在四个测试条件下（含有和不含ficoll的-80℃环境以及含有和不含ficoll的液氮环境）。试验冻存液中依然不含有FBS。-80℃含有ficoll细胞的植板效率和总细胞数与液氮对照组比较（图3E）。另外，Ficoll70对于液氮贮存没有负面影响。此外，只要Ficoll70存在，缺少FBS的低温冻存仍然保持效率（图3E）。再次，冻存在-80℃不含Ficoll的细胞与相关的其他组相比显示活力和繁殖能力严重降低（图3E）。
解冻后的H1细胞也通过流式细胞仪分析多能性标记物POU5F1的表达（图7）。它比在液氮中及含Ficoll70的-80℃中冻存的95%细胞表达量高。尽管极少数不含Ficoll的-80℃中冻存的细胞也表达这个标记物，它们在冻存中整体生存较差，但是没有证据表明大多数已经失去了多能性。
图3.原生态O2K猪iPSC细胞群落（A），外胚层型ID6猪IPSC（B），外胚层型人H1ESC（C,E）和外胚层型人iPSC细胞（D）超过延长的贮存期解冻后复苏。原生态细胞克隆（A）用Accutase将克隆分散成单个细胞。外胚层型细胞（B-D），用温和细胞消化试剂分散成小细胞团。人H1ESC在ROCKi（E）帮助下用TrypLE分散成单个细胞。细胞在下面条件下冷冻保存：样本中添加10%DMSO储存于液氮中（蓝色）；10%DMSO和10%Ficoll70混合存于液氮（紫色）；10%DMSO存于-80℃冰箱（红色）；10%DMSO和10%Ficoll70存于-80℃冰箱（绿色）。A-D中只用了FBS冻存介质。在E中测试了FBS和无血清冻存液都有的介质冻存，标尺是平均值±SEM(n=3),用不同字母a,b表示显著性差异(P＜0.05)
图4.-80℃Ficoll70中冻存复苏后的干细胞的多能性表型。（A-C）多能性标记物表达情况，分别是O2K猪iPSC（A）,ID6猪IPSC（B）,-80℃Ficoll70中冻存复苏后的H1hESC（C）。D图是自冷冻H1hESC细胞分化的胚状体标记物的表达：KRT7（滋养外胚层），DESMIN（中胚层），NESTIN（外胚层）和SOX17（内胚层）。E图是自冷冻保存H1hES分化的心肌细胞：顶层，博动的心肌细胞克隆，底层，心肌标记物TNNT2的表达。标尺=μm。
讨论
这个研究的主要目的是研发一种在-80℃热稳定的冻存介质，例如不存在再结晶，目的是为了提高干细胞在实验室冰柜长期贮存的效率，从而消除液氮的使用。这种介质被期望要保证细胞在运输和临时在干冰中贮存过程中的生存活力。为了完成这些目标，我们开发了基于Ficoll70的介质，它在水溶液中可以限制微量扩散和大分子的结构重组[48,49]。Ficoll70之前用于多种不同细胞在液氮中的冷冻保存[50-53]，但Ficoll不是由于像这里提出的可以阻止再结晶的能力而被选用的。
因为再结晶是一个自发的过程产生不可检测的潜热释放[22,23]，冷冻保存液模型的热稳定性通过测量去玻璃化温度（Td）来评估（表1；图1）。这个方法可行性是因为在溶液呈现高浓度情况下，Td总是低于但是接近再结晶开始时的温度[22,23]。如观察含有Ficoll70（Td-67℃）和Ficoll（Td-75.7℃）的溶液，如果在高于-80℃缓慢升温过程中测量Td，在那个温度下这被认为是热稳定的。所以，没有再结晶会发生在-80℃（表1）。这两种Ficoll聚合物，Ficoll70较好，因为在与DMSO等重量比时，它显示了更高的Td值。
随着再生医学领域越来越接近转化阶段，对动物模型的需求增大，如猪的生理学和解剖学比啮齿动物更类似于人[54-57]，利用动物来建立干细胞再生医学方案。所以，含有Ficoll介质的冷冻保护效率不仅在人ESC中做测试，也在两种猪的iPSC中进行测试，一种是原生态（O2K猪iPSC）[46]，另一种是外胚层型（ID6猪IPSC）[47]。原生态细胞的一大优势是它们冻存之后可以很容易地从单个细胞快速增殖，所以解冻后的细胞活力很容易被检测。在图2和图3A中所示的实验阐明了包含10%Ficoll70的介质可以保护原生态猪iPSC在-80℃冷冻保存一年以上的效率与在液氮中一样，而细胞冷冻贮存在不含Ficoll70的-80℃环境中质量迅速恶化，植板率和细胞数量逐渐减少证明了这一点，可能是因为随着贮存时间的增长大冰晶体的渐进形成[24,58]。
Ficoll70冻存介质对外胚层型猪和人源性的细胞冷冻贮存也是有用的，只要这些细胞克隆在冻存前被分散成小块或单个细胞。然而，甚至将克隆分散随后使用切割工具获得大小适中的细胞块（图5B），这是很多实验室使用的传统的传代方法[59]，贮存在含有Ficoll70介质的-80℃冷冻环境中效果也不好（图6）。我们怀疑Ficoll作为一种极强的扩散剂限制了细胞团中DMSO的扩散（图5B）。一个可能的解决办法是改变混合程序中的顺序，例如，在加入Ficoll之前在细胞悬液中添加DMSO。当用温和的细胞分离剂消化H1hESC时，复苏的克隆大小，在含Ficoll的-80℃冻存组比液氮对照组小（图3C右）。我们推断大的克隆是从包含更多活细胞的团块中形成的，而小细胞团是通过团块中部分死的而非全部细胞呈现出来的，这个现象在液氮冻存中并不容易出现。作为温和分离程序的一种替代，H1hESC可以用TrypLE消化成单独的细胞。然后他们解冻后最初在含有ROCK抑制剂环境中培养，防止细胞凋亡，在含有Ficoll70-80℃环境中冻存可以取得高的冷冻效率。
图5不同方法分离的外胚层干细胞。A图，外胚层型ID6猪IPSC培养过程中形态学；B图，用细胞传代工具手工将细胞分散成均匀团块；C图，用温和细胞消化试剂消化细胞克隆6分钟通常提供6-8细胞块；D图，用TrypLE将克隆消化成大量单个细胞。标尺=μm。
图6.冻存两周后ID6猪IPSC细胞克隆形成。细胞克隆用消化酶处理后被机械分成大小均匀的团块（图5B）然后冷冻保存。图A,不含Ficoll70液氮保存；图B，不含Ficoll70-80℃保存；图C，含Ficoll70-80℃保存。图像是解冻后四天拍摄。
综上所述，基于使用一种蔗糖的合成聚合物Ficoll70,我们建立了一个长期-80℃环境冷冻贮存人和猪的多能干细胞的简单方法，。因为添加10%浓度的Ficoll70对标准液氮贮存没有负面影响，所以它的存在使再结晶现象更加最小化，这使得后续样本运输可以使用干冰。我们推测这个方法的成功归功于Ficoll可以在冰柜工作温度范围内提高渗透性冷冻防护剂的热稳定性。另外，这个方法可以避免冷冻液中包含FBS，而细胞应用到临床FBS是不受欢迎的。最后，尽管我们北京哪个医院治疗白癜风得好苏孜阿甫片价格
