3悬浮培养用细胞培养基的选择和优化3.1悬浮培养用细胞培养基的选择根据细胞系和病毒株的特性，病毒在细胞内的繁殖方式不一样，所选用的工艺及细胞培养基也有一定的区别。有的细胞系在慢速增长或是不分裂状态下利于病毒的繁殖，有些细胞系则与病毒一起增殖，即与病毒的生产具有生长耦连性；对于细胞而言，有些病毒的生产属于分泌型，有些则是裂解型，不同类型所采用的生产工艺和细胞培养基不同，工业上根据悬浮培养生产工艺，通常把细胞培养液分为生长液、维持液和流加培养液等。生长液通常也称为完全培养液，主要是针对细胞生长而言，在培养过程中，细胞接种病毒前为满足细胞快速增殖的需要，需要的细胞培养基营养丰富或是添加一定剂量的血清，该种培养液可广泛应用于各种培养工艺。维持液通常是指在批培养过程中，接种病毒前，根据毒株特性不同，在不需细胞继续快速增殖，只需维持细胞活性、特异性的提高病毒复制繁殖速率、或是接种病毒以后不使用含有血清的细胞培养液的时候，需要更换的培养液，该种培养液依据不同的细胞系、病毒株或是生产工艺成分会有变化。如培养MDCK细胞生产流感病毒时，维持液中是否添加胰酶及胰酶的添加量均对病毒的增殖有明显影响。流加培养液是依据悬浮培养工艺中的流加培养方式而言，是指在流加培养时使用的细胞培养基。该培养基的成份不固定，是根据细胞的代谢速率及对营养成分的消耗进行调配，通常部分营养成份含量较高，可采用完全培养液的浓缩液或是部分营养成份的浓缩液。与静置培养的细胞相比，悬浮培养的细胞密度较大，悬浮培养时产生的剪切力等，除细胞自身的适应能力外，如前述，培养基的支持很重要，它能够维持细胞高密度生长，降低对细胞的损伤。此外，研究显示，在细胞由贴壁培养状态向悬浮培养状态转换时，细胞的代谢状况可能发生改变。在贴壁细胞及悬浮化适应后细胞的能量代谢比实验中，细胞在不同的生长状态下，悬浮适应后细胞的葡萄糖平均比消耗率、乳酸平均比产率及转化率均低于悬浮适应前，表明细胞经悬浮适应后提高了细胞对葡萄糖的利用率；在细胞悬浮适应后，葡萄糖消耗用于乳酸的产出比例在减少，而用于细胞生长、维持及蛋白生成的比例在增加。原因可能是与静置贴壁培养方式相比，悬浮培养时培养物的营养成份丰富且环境均一，一定程度上促进了细胞的生长，提高了细胞对葡萄糖的利用率，因此，培养基也应依据细胞的代谢需求进行变化。瑞士联邦科技学会生物工艺学教授Wurm博士在年指出：“培养基虽不是细胞培养中唯一重要因素，但确是最重要的一种”。尤其在大规模培养技术中，为维持细胞高密度甚至无血清生长，达到提高目标生物制品的稳定性、表达量的目的，培养基的营养含量则尤为重要。此外，由于不同细胞营养代谢状况、细胞和病毒培养工艺和抗剪切力能力均可能不同，因此，这些均需要个性化培养基的支持。LONZA公司在年的研究结果表明，采用优化后的限定化学成份细胞培养基与目录细胞培养基相比，蛋白表达量提高了9.6倍。3.2细胞培养基的优化细胞培养基经过天然细胞培养基、合成细胞培养基，发展到无血清细胞培养基，历近百年已发生质的飞跃，但直到现在，细胞培养基的优化仍是研究的热点。推动细胞培养基优化的主要原动力有两点：第一，提高细胞的产能，降低成本；第二，生物制品的安全性需求。提高细胞的产能，降低成本是工业化技术发展的原动力。国际上，目前针对提高悬浮培养技术产能的热点是优化培养基，与细胞驯化或是优化工艺技术相比，优化细胞培养基的成功率及实际效果更高，个性化、专业化细胞培养基是研究的热点也是未来细胞培养基的发展趋势。悬浮培养时，需针对细胞的增殖、病毒的繁殖特性及培养工艺等对细胞培养基的成份进行优化，如前述细胞由贴壁状态转为悬浮状态等，其代谢状况会发生一定的变化，如葡萄糖的代谢变化等，相应培养基的成份也不同；细胞的培养由贴壁培养转向悬浮培养时，搅拌产生的流体剪切力或是通气产生的泡沫效应，是悬浮培养时对细胞损伤最大的两个因素，目前除优化反应器的结构及生产工艺外，另外一个重要的方法就优化细胞培养基，通过在细胞中添加一定的保护剂，常用的PluronicF-68，其作为一种表面活性剂，已广泛用于哺乳动物细胞的大规模培养中。PluronicF-68对细胞的保护作用，目前主要有两种机制用于解释：一种认为Pluronic加入细胞培养基后，由于改变了细胞培养基的黏度而起到了保护作用；另一种认为由于PluronicF-68与细胞膜之间的相互作用，使细胞对剪切力的抗性发生了改变。而其他如聚乙二醇（PEG），可以改变培养液的表面张力，但仅对部分细胞有保护作用，且受分子量大小及浓度的限制。不同保护剂的保护作用机理及作用范围有一定的差别，在添加时也应适当选择。其次，生物制品的安全性需求促进细胞培养基向无动物来源成份、无蛋白的方向发展。法律法规对于生物制品原材料的质量要求逐步提高，生物制品生产越来越倾向采用无血清无动物组份培养基。无血清培养基杜绝了血清的外源性污染和对细胞毒性作用，使产品易于纯化、回收率高；其成份明确，有利于研究细胞的生理调节机制；可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和试验结果的重复。目前国际上生物制药生产中，已经有50%以上的产品采用无血清、无蛋白培养基生产，当前这些主要针对于人用生物制品，但是随着动物源性食品在人类食物中的比重日益增加、宠物等的快速增长等，增加了某些疾病在人类和动物的共染性，兽用生物制品的安全性及质量要求也在逐渐提高。目前国内首家无血清悬浮培养生产口蹄疫的生产工艺已获得农业部批准变更注册。与口蹄疫生产的常规含血清培养工艺不同，无血清悬浮培养工艺技术制备口蹄疫病毒最大的特点是工艺更简单、操作更简便，因全过程使用无血清培养，细胞在最后一级反应器中达到合适细胞密度后，补加一定量的新鲜培养基后直接接种口蹄疫病毒，无需进行细胞沉降换液去除血清等操作步骤，口蹄疫病毒毒力及病毒抗原含量无明显区别（表3-1和表3-2）。表3-1BHK21细胞无血清与低血清培养口蹄疫病毒毒力比较
表3-2BHK21细胞无血清与低血清培养口蹄疫病毒抗原含量（S）比较
除无血清培养基的持续研发外，当前细胞培养基的优化工作主要集中在流加培养基的设计和优化方面。流加培养基的优化常与代谢物分析及相关成份的化学计量衡算相结合，其目的是提供一个平衡的流加培养液，使得细胞生长过程中各种营养物质保持相对稳定的浓度。该模型早期主要由Xie等建立，他们在研究了细胞组成（蛋白，核酸，脂类，碳水化合物等）、产物组成（氨基酸）、维生素的利用率以及ATP需求的基础上建立了化学计量模型，用于设计流加培养基；Zhou等在分析杂交瘤细胞的生长代谢中氨基酸需求的基础上，定量计算出流加培养基中的氨基酸等配比。对于流加成份的研究，到目前为止，主要集中在葡萄糖、谷氨酰胺和其它氨基酸方面，原因是葡萄糖和氨基酸的代谢分析相对容易。对于较难分析的维生素、脂肪酸、微量元素等成份较少有文献提到，但维生素、脂肪酸、微量元素等成份的缺乏也会造成流加培养的营养限制，工业化中倾向于将浓缩的氨基酸和维生素、甚至浓缩的完全培养基应用到流加培养基中，细胞密度和产物浓度都有了提高，但是造成一些非必需添加成分的浪费，且营养成份及代谢副产物过度积累可能对细胞的增殖、产率及产品的质量有影响。但是逐一分析上述成份来寻找限制性因素，成本高，耗时长，成功率较低。因此，需要建立一种简单、快速、低成本的方法，在上述成份中筛查导致营养限制的因素。Franek等小组曾经利用稀释培养基和成分缺失的培养基筛选氨基酸和蛋白质中对细胞凋亡起作用的成份。虽然这些研究着眼于氨基酸和蛋白质对细胞凋亡的影响，但是这一方法同样可以用于细胞培养基中的维生素、脂肪酸、微量元素等难以进行代谢分析的成份中的限制性因素筛查。该方法开发的原理是，细胞培养基中的成分对于细胞生长和产物合成都是必需的，当这些成份低于某一浓度时细胞生长会受到抑制。与成份完全的细胞培养基相比，使用稀释细胞培养基和成份缺失的细胞培养基筛选限制性因素有以下优点：首先，细胞在被稀释成份耗尽后会生长停滞，发生限制时细胞培养基中除了被稀释的成份外，其它成份相对于细胞都是过量的，不会出现除被筛选成份以外的其它成份的营养限制；其次，在成份稀释的细胞培养基中，细胞密度不会达到很高，也就意味着不会产生高浓度的有毒代谢副产物（乳酸和氨等）而使细胞生长和产物增殖受到抑制。此外，采用统计学方法进行细胞培养基的理性设计也是无血清、无蛋白培养基优化方法的新突破；将高通量细胞培养系统和统计学方法结合将是细胞培养基优化的有力工具。虽然对于细胞培养基的优化方法快速发展，自动化水平及针对细胞代谢组学设计培养基的趋势下，但是针对不同的细胞系，相应细胞培养基的优化仍然要依赖于科学的洞察力和实践经验的积累。细胞培养基的优化工作仍较为繁琐且难度较高，是目前及未来相当长的时期内的一项艰巨的工作。
此外，对于细胞培养基安全性的研究主要集中在寻找一些关键的血清替代因子，用于设计和开发无血清细胞培养基。目前市售或是实验室研发的无血清细胞培养基中许多成份非常昂贵，不适宜规模化生产使用。因此，探寻一些对产品特性无影响的、化学成份明确、且原料来源方便及价格较低的因子也是未来的一个研究热点。
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