第四章牛血清与细胞培养技术
一、细胞培养基础知识细胞培养是指体外培养细胞的技术，即在无菌条件下，从机体中取出组织或利用已经建立的细胞系，模拟机体内的正常生理状态下生存的基本条件，让细胞在培养容器中生存、生长和繁殖的方法。
在过去几十年间，细胞培养从使用方瓶、转瓶培养等贴壁培养，发展到使用生物反应器、细胞工厂等设备进行大规模细胞培养。目前用于进行大规模培养的动物细胞主要有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞以及人二倍体细胞、CHO(中华仓鼠卵巢)细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero(非洲绿猴肾)细胞、杂交瘤等传代细胞。利用动物细胞培养生产的商业化产品主要包括多种疫苗(如人用疫苗中的人狂犬病疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、乙型脑炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗等；动物疫苗中的口蹄疫疫苗、蓝耳病疫苗、猪瘟疫苗等。)、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促红细胞素以及余种单抗药物等。
二、含血清的细胞培养方式细胞培养方式的分类很多，对用于细胞培养生长的器材分类，主要有如下几种：
1.方瓶培养凡是可用于培养生物有机体的瓶子都可以叫做培养瓶（cultureflask）。“方瓶”指表面积或容积较小的培养瓶，常用于细胞的原代培养、实验室培养等；而克氏瓶指表面积或容积较大的培养瓶，常用于细胞或毒种的扩增，是作为转瓶等规模培养之前使用的。早期的培养瓶主要是玻璃培养瓶，而今已发展为一次性使用的塑料（一般为聚丙乙烯）培养瓶。玻璃瓶有便宜、易清洗、能保持支持细胞生长特性、可进行干热或湿热灭菌、透光性好等优点，但在使用前需先用强碱（NaOH或腐蚀性去污剂）处理，然后再用酸中和后才可使用。一次性的无菌聚丙乙烯瓶透光性好、生长面平滑、质地均匀、易于生产。用于组织培养的塑料要经γ射线照射、化学处理或电离辐射，以产生亲水的带电表面。对于单层培养物来说，细胞产量与培养瓶的有效表面积成正比。通常按照表面积来描述培养瓶的大小，如25、75号培养瓶，有时分别称为T25、T75。
2.转瓶培养国内较早用于生物制品大规模生产的培养容器是转瓶（滚瓶），转瓶容积主要有2升、3升、10升、15升等。
转瓶培养使培养液流动，利于细胞吸收营养和进行代谢；使细胞接触气体而利于细胞呼吸和发生氧化还原作用，有利于细胞的生长繁殖；
瓶内的气体空间，可维持合适的氧和pH水平，转动可使细胞交替接触培养液和空气，营养可被充分利用；
结构简单、投资少、技术成熟、重复性好，放大只需简单地增加转瓶的数量或层数；
转瓶培养的缺点：
劳动强度和占用空间较大，单位体积细胞产率低，监测和控制环境条件较困难，瓶间差异难以控制。
3.细胞工厂细胞工厂是单层规模培养最简单的系统。该系统由长方形的Petri培养皿样单位组成，具有～CM2的总面积，通过两条垂直的管道分别在两个相邻角处互相连接。由于垂直管道的位置，只有将这个单位放到末端时，培养液才能在各分隔室之间流动。将这个单位转动并放平时，虽然互相连接的管口仍然使气相连接，但将每个分隔室中的液体隔开。
细胞工厂的特点：
多用于贴壁细胞疫苗生产；
实验室规模放大时不会改变细胞生长的动力学条件；
可提供不同的规格使放大变得简单易行；
低污染风险，并可节省空间。
4.Spinner培养Spinner培养系统是通过电磁搅拌器使悬挂于瓶内的磁棒（或叶桨）旋转，进行细胞悬浮培养，适合实验室或规模悬浮初试培养，常用的容积有ml、ml、ml等。其优点是无泡沫形成，细胞易于适应，无蛋白质沉淀析出。缺点是易形成细胞团块，易贴壁，培养体积不宜过深或过大。超过5～10CM（根据表面积与容量的比率）时，需要用CO2和空气进行充气，以便维持细胞进行适宜的气体交换。在培养中还需注意：
在培养中还需注意：
搅拌速度在30～rpm之间足以防止细胞沉降，速度不要过快，以免产生能够损伤的剪切力；
当血清浓度超过2%，尤其是向培养液内充气时，应当加入0.01%～0.1%抗泡沫剂（如PluronicF68）；
5.摇床培养年，第一台生物摇床诞生。随着生物技术的发展，出现了水浴摇床、带制冷的摇床、CO2摇床等。摇床可试用各种细胞的悬浮培养，如哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、细菌、真菌、昆虫细胞等。目前摇床配合细胞培养用的锥形瓶，主要应用在细胞培养基筛选、细胞悬浮培养驯化、克隆及生产前细胞放大。
摇床培养特点：
操作方便，一次性投入少；
适合探索性实验或中试，短期内获取大量实验数据；
培养体系中O2和CO2含量受环境影响较大；
细胞受到机械损伤较小；
放大生产工作量较大且细胞数量有限。
6.生物反应器培养工业化细胞培养过程一般由一系列逐渐扩大的生物反应器构成，其较好地模拟了细胞在体内的生长环境和对物质传递的要求。20世纪70年代以来，动物细胞生物反应器培养发展很快，在生产中使用的生物反应器规模从L至00L甚至更大。现在动物细胞培养主要使用机械搅拌式生物反应器，它可以全悬浮培养细胞，也可以利用微载体培养贴壁细胞。不锈钢搅拌式生物反应器体积从几升到几万升，一次性搅拌式生物反应器体积从几百毫升到0升。此外，还有波浪反应器、固定床式生物反应器等。生物反应器的培养方式主要有批培养、流加培养和灌注培养。[16]
7.生物反应器微载体培养微载体培养法是Wezel在年首先创建的，所采用的微载体是由天然葡聚糖聚合物或其他聚合物制成的固体小珠，其直径约在50微米到数百微米之间。培养动物细胞时先将微载体在血清中浸泡一下(可加快细胞与微载体的贴附速度)，然后将制备好的细胞悬液和微载体混合孵育一段时间，待细胞贴附于微载体上后再转移至培养液中培养，并借助温和搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中。这样细胞就能够在微载体表面迅速生长、增殖，细胞浓度可高达个/ml。
微载体培养是将贴壁细胞在生物反应器中悬浮培养的一种方法，提高了对培养液和培养空间的利用，而且适于各种贴壁细胞的大规模培养，收获过程简单，但规模不易放大。目前已广泛应用于动物细胞生物制品的规模生产。
微载体培养具有如下特点：
表面积大，单位体积培养液的细胞产率高；
细胞生长环境均一，方便监测和控制各种环境因素；
重复性好，收获过程不复杂；
不易放大规模；
适合于分批培养（batchculture）、流加培养（fed-batchculture）、灌注培养（perfusionculture）等操作方式。
三、牛血清适用现状不同的细胞培养需选择合适的细胞培养基以及相应的牛血清，如下表所示：
由于牛血清的纯天然属性导致批次间的差异不可避免，这种差异主要来源于不同的牛源个体、不同的牧场、气候条件、混合方式、冻存条件和时间差异等。在牛血清生产时只能尽量控制减少这些条件带来的质量差异，但仍无法完全避免。
尽管牛血清供应商在每个批次牛血清混合加工后会对牛血清进行各项指标的检测，其中包括理化指标、促细胞生长试验等。但是由于细胞培养同样存在许多不确定性，例如检测的细胞系不一样、同样的细胞系不同细胞株、不同的培养环境、不同的操作人员、不同的培养基等原因，导致前期出厂的促细胞检测数据只能作为参考。用户需不断地筛选尽可能接近上次使用的牛血清批次，这个周期相对较长，而且存在一定的隐患。
类似的问题在细胞培养基领域也同样存在。细胞培养基厂家目前采取的方法是为客户设计个性化的培养基，比如按照客户所采用的细胞株，生产工艺以及生物制品特点等研发设计出符合客户需求的培养基，如CHO细胞全悬浮培养无血清培养基、BHK21细胞反应器全悬浮培养高密度培养基、Marc细胞反应器微载体专用培养基、Vero细胞反应器微载体培养专用培养基等。这就表明个性化培养基的研发和生产离不开实际的生产要求，它既是培养基生产厂商研究开发的特定培养基，也是和生产厂家合作的结果。
如果牛血清供应商能够采取类似的思路，了解客户所采用的细胞株、生产工艺以及生物制品特点，设计出合适的方法为用户筛选牛血清，精准的为用户提供合适的牛血清批号并经过验证，这能为用户避免很多麻烦。
胎牛、新生牛血清
牛血清、成品预装培养基平皿
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