本文发表于SpringerNature
作者：JessicaC.Petrov等
急性髓系白血病(AML)中的杂细胞可以抵消基于单个CAR治疗的杀伤活性，从而导致疾病复发。与CD23表达相关的白血病干细胞(LSCs)是一个罕见的细胞群体，在疾病的进展和复发中也发挥着重要作用。在此，我们研究了一种同时具有针对两种不同AML抗原CD23和CD33的离散scFv结构域的混合CAR(cCAR)T细胞的抗肿瘤活性。我们确定所产生的cCART细胞对每个靶抗原群体具有一致、有效和定向的细胞毒性。采用四种白血病小鼠模型，发现cCAR治疗后小鼠体内存活较好。我们还设计了一种Alemtuzumab安全开关，允许在体内快速终止cCAR治疗。这些结果表明，CD23、CD33对AML细胞消除AML疾病和腰椎管狭窄症可能具有有效策略，并可能防止由于抗原逃逸或LSC的持久性引起复发。
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前言
AML是一种以未成熟髓样细胞恶性转化和过度增殖为特征的血液病，它取代了正常骨髓细胞。目前联合阿糖胞苷和蒽环类药物的化疗方案成功地治疗了少数患者以及甚至一些复发和/或难治性AML患者。异基因造血干细胞移植（HSCT）仍然是AML唯一可行的治疗方案，只有有限数量的患者符合条件。此外，50%-70%的患者在化疗和HSCT后复发，5年生存率为27%。考虑到目前AML治疗的缺点和过去几十年来治疗进展的停滞，迫切需要新的治疗方法。
CAR-T细胞免疫治疗是一种新的、功能强大的治疗方法，它已经成为治疗恶性血液病的一种有效方法，尤其是B细胞淋巴瘤和浆细胞恶性肿瘤，分别以CD9和BCMA为靶点。然而，在CAR治疗一年后，患者会出现大量复发。因此，一个单一CAR治疗目标，可能不足以防止疾病复发。因此，多个抗原的复合靶向是改善CAR治疗结果的关键。
将CAR-T细胞治疗转化为AML也需要仔细了解疾病的特点，以及驱动疾病的因素。AML的特点是存在异质性的爆炸细胞，这些细胞具有高度侵略性、快速分裂的细胞，形成大量的疾病。由于白血病干细胞(LSCs)在引发和维持疾病中的作用，AML的治疗具有独特的挑战性。LSCs由于其静止的性质，仍未受到针对快速分裂细胞的化疗的影响。成功的CAR治疗可以针对两种不同的抗原：()将大量靶向异质性恶性细胞与消除引起复发的LSCs结合起来；(2)提供多个靶点以限制单抗原复发。
CD33是一种髓系标记物，由于其在大量AML病上的特异性表达和在正常细胞上的弱表达而成为治疗AML的靶点。用gentuzumabozogamicin，即抗CD33抗体治疗CD33+AML复发的患者。因此，虽然以CD33为靶点可以消除大部分疾病，但补充一个额外的靶点将有助于消除CD33-白血病细胞或LSCs的再复发。研究了39例AML患者中发现87.8%例表达CD33。CD23也广泛存在于AML细胞中，同样39例AML患者的研究发现，9.4%的AML表达CD23而不表达CD33。因此，将CD33和CD23结合在一起，可以防止与复发相关的抗原逃逸。
CD23(白细胞介素3受体α链)在AML中高表达，是理想的靶点。重要的是，它在CD34+CD38-lSCs上高表达，在正常造血干细胞(HSCs)中缺失或极低表达。CD34+CD38-细胞被定义为LSCs，因为它们能够启动和维持免疫缺陷小鼠的发生白血病。CD34+CD38-CD23LSCs的数量对AML患者的治疗效果有预测作用。虽然AML是一种异质性的疾病，但大多数AML样本要么表达CD33，要么表达CD23，或者两者同时表达。因此，以CD23和CD33为靶点可以消除大多数患者的AML。
在我们的临床前研究中，我们设计了一个表达离散的抗CD23和抗-C33CAR的CD23b-CD33bCCAR，以同时针对AML中的主体白血病细胞和LSCs。此外，双重靶向提供了更全面的消融，并可能克服单一抗原治疗因为抗原丢失而导致复发的缺陷。我们发现CD23b-CD33bcCAR(23b-33bcCAR)T细胞在体外和体内均能特异性地杀伤表达CD23和CD33的白血病细胞。我们还发现，23b-33bcCAR在消除患者标本中的LSCs和白血病细胞方面显示出显著的效果。作为一种安全开关来保护我们的cCAR的高效能，我们开发了一种迅速消除所有残留的cCAR在白血病小鼠模型策略。总之，这项研究支持23b-33bCCAR的发展是一个很有前途的治疗AML。
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研究发现
（）CD23-CD33CCAR(23b-33bcCAR)T细胞的制备图23b-33bcCAR构建与表达。a一个单元：一个抗cd23b离散的CAR包括：一个CD8（H）来源的铰链和跨膜（TM）区域、4-BB和CD28共激活作用域与CD3ζ信号结构域融合到一个完整的anti-cd33b可自裂解的P2A肽。强脾焦点形成病毒启动子（SFFV）和CD8的前导序列进行了23b-33bcCAR分子在T细胞表面的高效表达。b流式细胞术检测T细胞的表达。c23b-33bcCAT-T细胞双管齐下的方法示意图。
（2）23b-33bcCAR-T细胞有效杀伤急性髓系白血病细胞株为评价23b-33bcCART-细胞的细胞毒性，我们对AML细胞系MOLM3(CD23CD33)和U(CD23-CD33)进行了共培养试验。23b-33bcCAR细胞24h毒性的流式细胞分析结果表明，在E(效应细胞)：T(靶细胞)比分别为2：和5：时，MOLM3和U肿瘤细胞几乎完全溶解(90%)(图2A，补充图S4A)。
我们进一步评估了23b-33bcCAR对另外两个AML细胞系KGa(CD23CD33)和HL60(CD23Dd33)的剂量依赖性细胞毒性。用E：T比为0.25:，0.5:，:，2:，5:和0:，23B-33bcCAR即使在0.25:的比例下也表现出较强的溶解能力(图2c)。白血病细胞表型结果在补充图S体现。
（3）23b-33bcCAR-T细胞的离散受体单位以抗原特异性方式独立裂解靶细胞为了进一步证实cCAR的独立抗原靶向性，我们确认了CD23(Jurkatxp23)或CD33(Jurkatxp33)高表达的T-ALLJurkat细胞株及其独立表达的特性(附图S)。为了确定靶向功能，除野生型Jurkat细胞与这类细胞共培养外，我们还将23b-33bcCART细胞与这类细胞共同培养（图2b）。我们发现23b-33bcCART-细胞与野生型Jurkat细胞相比，特异性地、有效地裂解(90%)Jurkatxp23和Jurkatxp33细胞(补充图S4B)。总体而言，23B-33bcCART-细胞表现出针对主体细胞有效的细胞毒性，可裂解表达不同靶点组合的细胞群体，并且这些细胞只表达一种抗原(图2)。
图b-33bcCART细胞显示肿瘤细胞有靶向性裂解，所有目标种群都被包围。流式细胞仪分析E:T在2:和5:时，对照T细胞和23B-33bcCART-细胞对MOLM3(CD23CD33)或U(CD23-CD33)肿瘤靶细胞的杀伤作用。a流式细胞仪分析对照T细胞和23B-33bcCART-细胞在2:和5:的E:T条件下对MOLM3(CD23CD33)或U(CD23-CD33)肿瘤靶细胞的杀伤作用。b流式细胞术分析对照T细胞和23B33bcCART-细胞对野生型Jurkat肿瘤细胞和表达CD23(Jurkatxp23)或CD33(Jurkatxp33)的Jurkat细胞在E:T为2:时杀伤作用。c用HL60(CD23CD33)和KGa(CD23CD33)细胞进行剂量依赖性培养，在E:T为0.25:到0:的范围内具有较高的cCAR杀伤效率。
（4）23b-33bcCART细胞有效地裂解白血病原发肿瘤细胞接下来我们建立了23b-33bcCAR对4例原发性白血病患者的抗肿瘤特性，其中包括2例CD23CD33AML和2例CD23+B-ALL样本(PT：AML，PT2：B-ALL，PT3：AML和PT4：B-ALL)（附图3，补充图S4C)。与以前的抗肿瘤细胞毒性和对AML细胞的杀伤作用(图2)相比，23b-33bcCART细胞显示出对所有患者样本的抗白血病活性相似，2:时肿瘤裂解率80%，在5:的比率下肿瘤裂解率98%。
我们还检测了23b-33bcCAR对PT3样本中的LSCs(CD23+CD34+CD38-)和PT4样本中的髓系白血病(CD34VariableCD33+)消除的能力(见图3c，d)。我们发现，23b-33bcCAR-T细胞能成功清除LSCs和主体疾病细胞(补充图S2)。
图b-33bcCART细胞显示对原发肿瘤细胞的定向裂解，所有目标细胞被包围。a流式细胞术分析对照T细胞和23B33bcCART细胞在2:和5:E：T比下对PT肿瘤靶细胞的杀伤作用。b流式细胞术分析对照T细胞和23B33bcCART细胞在E:T为2:和5:时下对PT2肿瘤靶细胞的杀伤作用。c流式细胞术分析对照T细胞和23B33bcCART细胞在E:T为2:和5:时对PT3肿瘤靶细胞的杀伤作用。CD38的表达进一步破坏了靶细胞群(CD23+CD34+CD34-)，以显示LSC(CD23+CD34+CD38-)的消除。dE:T为2:和5:时对PT4肿瘤靶细胞(CD33)的流式细胞分析。
（5）23b-33bcCAR-T细胞在体内具有较强的抗肿瘤活性为了评价23B-33bcCAR-T细胞的体内抗肿瘤活性，我们用荧光素酶表达的MOLM3(CD23CD33)或U(CD23-CD33)细胞建立了两种诱导荧光可见肿瘤形成的小鼠模型。23b-33bcCAR细胞可显著降低MOLM3和U小鼠的肿瘤负担，延长生存期。小鼠分别给予单剂量的23b-33bcCAR-T细胞或对照的T细胞，并通过IVIS成像检测对肿瘤负荷检测。异种移植模型中，对照组与23B-33bcCAR治疗组从第6天开始，肿瘤负荷的IVIS测量有显着性差异(P0.)（图4b，e)。到第3天，注射23B-33bcCART细胞的小鼠肿瘤负荷比对照组低92~99%。此外，cCAR处理的小鼠也有更好的生存结果(两组小鼠的P值=0.)(图4c，f)。
我们还评估了在CAR-T细胞和肿瘤细胞的持久性。采集外周血，通过流式细胞术检测其中的移植瘤(MOLM3或U细胞)和T细胞(cCAR或对照组)。相比而言，对照组小鼠的外周血中表现出有明显的残余肿瘤（~75–87%），而通过23b-33bcCAR治疗的小鼠外周血中所有的肿瘤细胞均被清除（补充图S3）。此外，23B-33bcCAR处理的小鼠外周血中表现出明显的T细胞增殖和持久性，即外周血中几乎所有的人类细胞都是cCAR-T细胞。
图B-33bcCAR-T-细胞对MOLM3和U细胞具有明显的抗白血病作用。a小鼠模型用MOLM3细胞诱导可测肿瘤形成。b小鼠用23B-33bcCART细胞或对照T细胞处理。肿瘤负担在第3、6、9和3天出现(左面板)右边，如b图形表示。c对数秩检验对改善实验组生存率有显著意义（P＝0.）。d采用U细胞诱导形成的小鼠模型可测试肿瘤形成。e小鼠用23B-33bcCART细胞或对照T细胞处理。肿瘤负荷在第3、6、9和3天出现(左)(面板)右如e图表示。f对数阶mantel-cox检验表明对改进实验组生存率具有重要意义(P=0.)
为了检测CD23+或CD33+细胞的清除，并验证复合scFv的疗效，我们建立了两种独立表达每种抗原的异种移植小鼠模型(Jurkatxp23或Jurkatxp33)(图5)。两组均给予23b-33bcCAR和对照组T细胞，检测其独立抗原靶向性。对照组与23b-33bcCAR治疗组从第7天起，Jurkatxp23小鼠肿瘤负荷的测量值与对照组相比有显著性差异(P0.)，而Jurkatxp33小鼠的肿瘤负荷测定最早在第3天就有显着性差异(P0.05)(图5b，e)。到第8天，23B-33bcCAR处理的Jurkatxp23小鼠几乎没有肿瘤细胞(%肿瘤负荷)，Jurkatxp33小鼠只有0%只残留肿瘤。
图b-33bcCART细胞在两种体内异种移植小鼠模型中表现出离散的抗原靶向性。利用Jurkatxp23细胞诱导可测肿瘤形成的小鼠模型。小鼠用23B-33bcCART细胞或对照T细胞处理。肿瘤负担在第3、7、0、4和8天(左面板)显示，右边如图b表示。CKaplan–meier生存曲线代表的生存结果。小鼠Jurkatxp33细胞诱导可测肿瘤形成模型。小鼠用23B-33bcCART细胞或对照T细胞处理。肿瘤负担第3、7、0、4和8天(左面板)显示，并在右图e表示。fKaplan-Meier生存曲线代表生存结果。
（6）体内Alemtuzumab(阿利姆佐马)可使23b-33bcCAR-T细胞迅速耗尽由于cCAR治疗存在的预期之外的副作用，急性髓细胞白血病(AML)患者在肿瘤耗尽后可能需要开发安全的方法来消除23b-33bcCAR-T细胞。T细胞在细胞表面表达CD52，CD52特异性抗体Campath(Alemtuzumab)能消除血液循环系统中CD52+细胞。
为了评价阿利姆佐马(Alemtuzumab)介导的耗竭策略作为23b-33bcCAR-T细胞天然安全开关的可行性，我们建立了一种小鼠模型。全身注射23b-33bcCAR-T细胞。用阿利姆图单抗治疗小鼠，并按图中所述的流程对组织进行分析(图6a)。阿利姆图单抗给药6h后，流式细胞仪分析证实循环外周血中23b-33bcCAR-T细胞耗竭~(90%)(图6b,补充图S5A)，其耗竭率在48h后达到98%图6C,补充图S5A)。此外，阿利姆图单抗给药5天后，23b-33bCART-细胞几乎从外周血、脾脏、肝脏和骨髓中被根除(补充图S5B)。因此，Alemtuzumab能迅速有效地消除外周血cCAR-T细胞和组织浸润的cCAR-T细胞。这些发现支持使用Alemtuzumab作为一种天然安全开关来消除循环系统中的23b-33bcCAR-T细胞。
图6Alemtuzumb治疗后注入23b-33bcCART细胞的耗竭。a用实验方法评价23b-33bcCART细胞输注NGS小鼠后给予Alemtuzumb的效果，b流式细胞术分析6小时后外周血中23B-33bcCART细胞持续存在的表达。代表23B-33bcCART-细胞在外周血中的持续时间。c流式细胞术分析显示24小时后外周血中注入的23B-33bcCART细胞持续存在的表达。
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讨论
在CD9CAR治疗的B-ALL患者中常见到~90%初步缓解率，大多数在一年内复发。复发可能是由于不完全的嵌合抗原覆盖导致抗原逃逸所致。因此，基于单一治疗目标可能不足以防止白血病复发，迫切需要更有效的CAR-T细胞治疗以防止复发。单一CAR的AML治疗对抗原逃逸也有类似担忧，强调双向靶向治疗的重要性。
CD23和CD33是很好的cCAR靶点，因为几乎所有AML细胞都表达这两种抗原。我们开发了一种同时针对CD23和CD33抗原的cCAR，作为一种更全面的疾病消除策略。联合CD23-CD33靶向治疗AML，可通过防止抗原丢失引起的复发，克服单抗原治疗的缺陷。虽然在抗原特异性选择压力下丢失单个抗原是可能的，但同时丢失两种抗原的可能性要小得多。
AML的一个重要预后指标是微小残留疾病，即治疗后残留的少量白血病细胞。这些细胞主要由LSCs组成，能够逃避常规化疗，导致复发。纯化的CD34+CD38-白血病细胞本质上是过度表达CD23的LSCs。尽管目前的治疗方法是通过消耗这些细胞来减少疾病的复发，但它们不能消除LSCs，从而导致疾病复发。一个更成功的策略是同时针对疾病(CD23+CD34+CD38-LSCs)和大部分疾病(CD33+母细胞)的根源细胞。针对AML患者的CD23或CD33的治疗方法有多种，包括抗体药物结合和可招募抗体的T细胞构建。这些方法取得了有限的成功，复发率很高，这可能是因为无法同时针对大量疾病和LSCs。一些临床试验使用CARs分别针对CD23(NCT，NCT)或CD33(NCT；NTC；NCT；NCT)。虽然初步数据很少，但成功程度有限。在一项小型临床试验中，用CD33CART细胞治疗例难治性AML患者，CD33+母细胞在两周时减少，但在治疗后第9周恢复到较高的水平，并伴有不良副作用。同一组还治疗了一名患者抗CD23CART细胞，并报告没有明显的抗白血病作用。虽然这些试验中没有足够的数据来得出结论，但这些早期的结果表明单抗原靶向可能不足以阻止AML的发展和疾病的进展。
为了提供更有效和更全面的覆盖范围，以消除LSCs和主体细胞疾病，并尽量减少抗原逃逸，我们提出了联合CD23和CD33靶点的cCAR治疗方案。FDA已经批准了这种针对AML的孤儿药物23B-33bcCAR的申报(#7-)。为了研究23B-33B复合CAR(23b-33bcCAR)的疗效，我们确定了三种治疗AML的可行性标准。首先，它对AML细胞株和患者肿瘤样本具有基本的细胞毒性作用。第二，每个离散的cCAR单元在体外和体内都能独立地靶向其抗原并消除只表达一种抗原或同时表达两种抗原的靶标。第三，我们能够在体内迅速而彻底地终止cCAR。
我们首次发现，23b-33bcCAR对白血病细胞株和患者肿瘤具有显著的细胞毒性作用，杀伤率接近00%。cCAR针对多种原发白血病样本进行靶向治疗，并有效地清除CD23+LSCs和CD33+AML主体细胞。我们进一步证明了cCAR的显著杀伤能力，通过剂量依赖性的共培养，效应细胞：靶细胞（E：T）比率低至0.25:。与23bcCART细胞进行的低剂量共培养可与较高的E:T比率相媲美，这表明cCAR技术是非常强大的。
接下来，我们通过独立检测每个靶点(CD23、CD33-或CD23-CD33)，验证了复合治疗针对多种抗原的能力。实验结果表明，在共培养和小鼠模型中，23b-33bcCAR均能独立地抑制表达的JCD23urkatxp23细胞和表达的CD33Jurkatxp33细胞。与对照组相比，23b-33bcCAR处理后小鼠的存活率有提高的趋势。我们还发现，23b-33bcCAR对MOLM3和U细胞具有持续的体内活性，并且在这两种模型中都有较好的小鼠存活率。小鼠最终的白血病复发可能是由于人类CAR-T细胞有效穿透所有小鼠白血病细胞池的能力有限所致。其他团队也有报道，存在着潜伏白血病细胞池，并导致疾病的发生。此外，携带人类恶性肿瘤异种移植物的小鼠不能够再现人类的微环境，从而使CAR-T细胞增殖达到至0倍。重要的是，所有经cCAR处理的小鼠血液组织中基本上没有肿瘤，在这些端点有大量的扩增的23b-33bcCART细胞，这表明每个单位都是功能完全且足够独立的。
