慢病毒载体：（1）FUGW(2)PLVX系列（PLVX-puro，PLVX-IRES-mcherry，PLKO.1）（3）pLenti系列（pLenti-CMV-EGFP）（4）pLentiLoxP（pLL3.7）；（5）pCDH（pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP）
包装质粒：（A）Pspax+pMD2.G;(B)pMD2.G+pMDLg/pRRE+pRSV-Rev；（C）pdelta+pMD2.G
细胞：HEKT；HEKFT
2实验步骤1、10cm的培养板，种HEKT，达到70%-80%密度时，先换9ml无血清10%FBS的DMEM，之后准备转染。
2、将Ca转试剂盒(百*维)中，取A液ul到EP管A中。
3、B液50ul到EP管B中，向管B中加入质粒DNA共25ug（PLVX/pLenti：Pspax2：PMD2.G=4:3:1），吹打混匀，再加入超纯水至ul总体积。
4、静置约5min，将B管液体逐滴加入到A管中（此时应用另外一只手拿ul的枪不停吹打A管中的液体（气泡法），注意一定是B加入到A，不可反着加）。
5、RT静置30min，后可见细微浑浊悬液，为DNA-Ca3(PO4)2复合物。逐滴尽量分散的加入到培养皿中。
6、将培养皿在平面上画十字5次，使得DNA复合物均匀的分散在整个皿表面。
7、20h以内换液，换为10ml新鲜的含双抗的30%FBS的DMEM，继续培养。
8、转然后48h，收第一次病毒原液（上清），后再加入10ml完全培养基，72h第二次收上清。
9、将病毒原液g离心10min（可以RT），后小心的吸取上清，至另外一个离心管中，加入1/3体积的4X的Lenti-Xconcentrator，多次反复倒置混匀，立即放入4度冰箱过夜。
10、取出加过Lenti-Xconcentrator的病毒液（立即置于冰上），可发现内有悬浊絮状沉淀，4度1g离心45min。
11、小心吸取并弃掉上清，尽量吸干净。加入原体积1/20的完全培养基，重悬PEG-病毒复合物，得到悬浊液。该悬浊液可用于感染目的细胞，或者感染HEK细胞来计数病毒滴度。
心得/问题：
1、Ca转法转染效率和表达明显高于lipo0转染法，细胞的形态也好很多很多，产病毒量也多至少一个数量级。
2、PEG溶解的时候，尽量用不含血清的培养基或者PBS溶解。这样能增强溶解性。
3、pLenti质粒制备病毒的效率似乎远远大于PLVX质粒，不知道是因为抽屉pLenti质粒去了内毒素的原因，还是因为pLenti本身产毒能力就大于PLVX？
4、感染后72h，镜下计数了10ul病毒液+ul2%FBS-DMEM感染48孔板1个孔，大约在10X镜下，视野直径是48孔板一个孔直径的1/4到1/5，则视野面积大约是1个孔的1/20。
此时对于PLVX系统，平均1个视野内约有个以上感染阳性细胞，则滴度=个*20倍视野*倍体积=2*10E5。用ul病毒原液感染过6孔板（长满约为2*10E6个细胞），大约感染率为20%-50%，也就是说滴度=2*10E6*0.2/0.5=8*10E5。数量级上的估计与48孔板计数没有差。
对于pLenti系统，平均一个视野内阳性细胞数至少是PLVX系统的5-10倍，则估算滴度至少在1*10E6以上。
5、浓缩后的病毒液感染HEK，72h后镜下观察，发现PLVX系统40ul浓缩悬液+ul培养基感染一个48孔板的1孔，效率几乎达到%，荧光非常亮；Plenti系统10ul浓缩液+ul培养基也达到同样效果。
从最后(96h)结果上看，40ul的病毒浓缩悬液效果铁定比10ul浓缩悬液要好非常多，但是奇怪的是，感染后48h看荧光反而是10ul的荧光比40ul的好很多很多。不知道为嘛。
6、1g（3rpm）离心结果好像病毒都甩丢了，似乎1rpm反而保留住了绝大部分病毒。（why？）
7、增大血清浓度到FBS=30%，能显著提高出毒的滴度（至少一倍）。转染时加25uM的CQ或者加5mM的丁酸钠，对出毒效果的影响不明显。
8、病毒原液过Millipore的KD的15ml超滤管之后，能被浓缩10-倍，但是FBS也被浓缩了。
可能考虑改进的地方：
1、转染前一天就用无双抗的培养基养细胞，细胞每周传代3次。
2、转染前1h加CQ至终浓度25uM，加丁酸钠终浓度为5mM，帮助转染；
3、转染后6-12h换液，换为含1%BSA+10%FBS的DMEM，并且额外添加非必须aa以及L-Glutamine。
4、考虑用超滤管(Millipore,20ml,kD)进行第一步浓缩，之后再用LentiXconcentrator进行第二步浓缩，这样是不是浓缩效果更好，还省LentiXconcentrator？
5、考虑收病毒前Nmin使用高钾刺激（或其他刺激）促进胞吐，看是不是瞬时病毒产量更多。
?
3实验结果载体用PLVX-AcGFP(带puro)，辅助质粒有以下几种：孔1、psPAX2、pMD2.G（4:3:1）孔2、pPACK-H1-Gag、pPACK-H1-Rev、pPACK-H1-Vsvg（3:1:1:1）孔3、PLP1、PLP2、PLP-VSVG（3:1:1:1）孔4、pMDLg/pRRE、pRes-Rev、pCMV-VSVG（3:1:1:1）孔5、pCMV-deltaR8、pCMV-VSVG（4:3:1）然后，使用LentiXT产毒（我已试过，比HEKT或者FT效率高多了），每个孔转染4ug质粒，6h换液2ml，48h收毒。取-80度冻过一次的病毒上清ul+ul新鲜培液+8ug/ul的polybrene感染密度为70%左右的HEKT6-12h，后换液为正常培液，3-4天镜下荧光计数，推算病毒滴度。以下是感染图，荧光视野和黑白视野。由于各套系统辅助质粒比例不确定是最优，另外，骨架载体用的是PLVX系列，所以可能我的结果不具有代表性，只能说明我自己这次做的，给大家一个参考。用感染阳性细胞推断滴度，第一孔产的原液滴度大约在5*10的7次。可能是骨架小的缘故吧。另外，第一个孔那么亮，是不是因为有tat呀？
大家可以留言讨论一下。拍摄条件都相同的。
投稿请联系：dalincn
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