慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
重组慢病毒的产生：瞬时转染法，即将包装结构和载体结构瞬时共转染法如T高表达细胞系而产生重组慢病毒。此法非常成功，大多实验室采用此法。包膜质粒、包装质粒与载体质粒共转染(多用磷酸钙共沉淀法)T细胞直接产生生产细胞。最后重组慢病毒分泌到培养基中进行培养而得到大量载体慢病毒。
操作过程：
一、慢病毒载体的构建
选用合适的载体进行慢病毒过表达载体的构建，构建方法与普通质粒构建相同。
实验室现有过表达的载体如下：（pLV-AcGFP1-N1，pEB-GP，pLVX-Puro，PTK，pLV07），包装质粒有两套：psPAX2、pMD2.G；VSVG、NRF。
二、慢病毒包装
利用HEKT细胞进行慢病毒包装，同时包装阴性对照组即空载质粒
（注意：HEKT细胞贴壁不牢，包装过程时间太长可能导致细胞漂浮，影响包装效果，故在HEKT细胞种板前可用0.1mg/ml多聚赖氨酸包被皿底）
（1）在60mm培养皿中接种7×HEKT细胞，37°C，5%CO2条件下培养过夜。
（2）细胞长至50%-80%时进行转染。按以下体系配制转染混合液，轻轻吹吸均匀，室温静置20min。
-3μgpEB-GP或pEB-GP-NRSF
-2.25μgpsPAX2
-0.75μgpMD2.G
-12μLTurbofectTransfectionReagent
-μLOpti-MEM
（3）均匀逐滴加入到细胞培养基中，轻轻晃动平皿使混合均匀。
（4）37°C，5%CO2培养12-15h，更换新鲜培养基，注意从平皿边缘缓慢加入新鲜培养基，避免把细胞吹起。
（5）37°C，5%CO2继续培养24h后进行第一次收集。小心地吸取上清至15mL离心管中，4°C短期保存。加入5mL新鲜培养液，继续培养。
（6）24h后进行第二次收集，然后将两次收集液合并，1rpm离心15min，小管分装，-80°C保存。
（7）收集到的病毒可以进行浓缩和病毒拷贝数测定，都有试剂盒可以使用。
三、筛选标记（以嘌呤霉素为例）最低致死浓度测定
在慢病毒侵染细胞前，需要测定筛选标记嘌呤霉素（puromycin）对不同细胞的最低致死浓度。
（1）在6孔板中接种7×细胞，37°C，5%CO2条件下培养。
（2）配制含不同嘌呤霉素浓度的培养液，使设置嘌呤霉素终浓度为0μg/mL（嘌呤霉素对照）、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1.6μg/mL、3.2μg/mL。
（3）细胞长至80%-90%时，将培养基换成含有不同嘌呤霉素浓度的培养基。
（4）每天显微镜下观察，并隔天换成含有不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养液。
（5）3-5d后，导致细胞全部死亡的最低嘌呤霉素浓度即为嘌呤霉素最低致死浓度（一般以4d完全致死为准）。不同细胞的嘌呤霉素最低致死浓度不同。
四、慢病毒侵染及检测
（1）在培养皿中接种适量细胞，37°C，5%CO2条件下培养过夜。
（2）待细胞长至80-90%时更换新鲜培养基，培养基中加入终浓度为8μg/mL的聚凝胺（polybrene），增加侵染效率。
（3）以6孔板为例，加入-μL慢病毒上清液，37°C，5%CO2继续培养。
（4）培养至少24h后更换培养基，培养基中加入含有最低致死浓度的嘌呤霉素。每隔一天更换一次含有该浓度嘌呤霉素的新鲜培养基。
（5）嘌呤霉素将阴性对照组细胞杀死时，将病毒侵染后存活的细胞进行稀释传代至60mm板中，细胞密度应为，细胞单个独立分布，可以长出一个单克隆为宜。将细胞长成一个肉眼可见的单克隆（约两周以上），将单克隆挑到96孔板中，然后细胞在根据情况扩大到24孔板，12孔板，6孔板，10mm板中培养细胞。备注：挑单克隆时可以多选择几个细胞，待细胞长成后根据细胞荧光强弱和检测得过表达情况，选择一株表达效果好的细胞。即为稳定表达某基因的细胞系
（6）稳定细胞株构建后，进行细胞各项指标检测。
构建好的稳转细胞系如下：
