5.2.5渗透压渗透压是动物细胞在体外培养时的重要环境参数。渗透压的升高将抑制细胞的生长。该种抑制产生的原因可能有两个：一种是影响许多酶反应，尽管细胞的多种生化作用需要特定的无机离子，但是过高的离子浓度可能会产生有害作用，这一现象得到Yancey等的研究证实。另外一种渗透压的升高可能影响了一些与细胞DNA合成有关的过程，致使较多的细胞停滞在S期，细胞生长速率降低，这一现象也得到一定程度上的研究证实。但是也有研究显示，渗透压的升高对于细胞凋亡几乎没有影响，并且细胞对于一定程度上的渗透压的变化具有一定的适应能力，渗透压升高后一些胞内氨基酸的量有明显的短时逐渐升高现象，保护细胞免受渗透压的升高。并且渗透压一定程度上升高还可能提高产物生成率。但是，渗透压过高时，该种效应则消失。因此，维持渗透压在正常范围之内仍具有重要的作用。对于渗透压的测定是一项很重要的质控步骤，如果在细胞培养基中添加了某些成份，测定渗透压就更为重要。动物细胞大规模培养过程中，随着乳酸等副产物的产生，加入NaHCO3控制pH值、或者流加培养过程中高浓度营养浓缩液的添加，渗透压通常都会有不同程度的升高。5.2.6代谢平衡控制细胞内的化学反应是在酶的作用下完成的。这些反应不是独立的，是相互联系的和受到调节的。一个反应的产物往往就是下一个反应的底物，由此构成的一系列反应，称之为代谢途径。在动物细胞培养中，主要以葡萄糖、氨基酸作为代谢的起点底物，通过糖酵解、三羧酸循环等能量代谢途径，分解葡萄糖或者氨基酸，为细胞的生长和产物的合成提供必要的能量，同时其代谢一些有毒产物，如乳酸、氨、活性氧簇、其它代谢物等在细胞培养液中长期积聚，会抑制细胞生长，并可能将使细胞最终失去活力和生产力。代谢控制的优化一方面是保证关键营养物质保持在一个合适的水平以满足细胞增殖需要。这些营养物质主要包括葡萄糖和氨基酸等，随着细胞的生长，这些营养物质会不断消耗，进而就会影响细胞的生长甚至导致细胞的死亡，为了维持细胞的生长，需要在细胞培养过程中补加营养物质。为控制培养体积，补加的培养液常常是含有营养物质的浓缩液。同时从细胞生长动力学和有毒废物产生速率来考虑，细胞生长的营养物质必须控制在一个比较低的水平，这就需要在培养过程中不能一次性加入营养物质浓缩液，而是根据浓缩液的营养成份及细胞代谢情况采用合适的流加策略。在实际培养过程中，保持细胞培养液中的营养物质含量比较容易，但是控制营养物质的最优代谢是一个研究控制点，通常通过检测代谢反馈的有毒物质含量（乳酸、氨等）来调节。需要检测的基本参数包括葡萄糖的消耗速率、谷氨酰胺的代谢速率、乳酸和氨气等有毒物质的生成速率等，同时还要考虑培养环境中pH及渗透压的变化等等。另一方面就是降低有毒物质的产生。主要包括乳酸、氨、丙氨酸等。乳酸对细胞生长的不良影响主要是改变培养环境的pH值和渗透压，间接影响细胞的生长、代谢和产物合成。大量研究显示，乳酸主要来源于葡萄糖，乳酸的含量在一定条件下随葡萄糖水平的增加而增加。培养液中葡萄糖水平高时，细胞更趋向于进行糖酵解作用，大量葡萄糖不完全氧化生成乳酸；在葡萄糖水平低时，细胞更趋于进行三羧酸循环，葡萄糖完全氧化生成二氧化碳。当细胞长期处于低浓度葡萄糖培养环境时，细胞的新陈代谢会转向更有效率的状态，其特点是乳酸的产生急剧减少，细胞新陈代谢从高乳酸产生转为低乳酸产生，这种改变有人称之为“代谢漂移”。目前有大量研究集中在流加培养过程中通过限制培养液中葡萄糖浓度来控制乳酸的水平。年Gambhir等在杂交瘤细胞的流加培养过程中，比较了葡萄糖在不同控制水平下的培养效果。当葡萄糖控制在较高水平10mmol/L-4mmol/L左右时，在这一范围内，乳酸产生速率较高，乳酸的积累需要添加碱以维持培养环境的pH值，此时营养的添加速率约与碱的添加速率相当，终细胞浓度达到7.5×cells/ml，培养液中乳酸积累的终浓度将近70mmol/L。在培养时当将葡萄糖浓度的设定点为0.3mmol/L，培养液的添加基于实时监测的细胞耗氧速率(OUR)，细胞持续处于非常低的葡萄糖浓度，使细胞的代谢转变为乳酸产生较少的状态，终细胞浓度达到11.5×cells/ml，乳酸浓度仅累积至40mmol/L。该结果说明通过降低葡萄糖在培养基中的存在浓度，可以调节细胞的葡萄糖代谢通量，在低浓度葡萄糖水平时，细胞消耗的葡萄糖经由糖酵解途径生成乳酸的比例较少，而进入三羧酸循环或磷酸戊糖途径的葡萄糖的比例增加。也有较多报道认为葡萄糖浓度的变化可能只是引起乳酸产率下降的原因之一。由于细胞生理状态的改变（有血清至无血清、贴壁培养转至悬浮培养），细胞的代谢途径也可能会发生变化，细胞同时消耗葡萄糖及乳酸，用于维持细胞的活力。笔者实验室在使用生物反应器培养CHO细胞时，采用流加培养工艺，控制葡萄糖浓度维持在较低水平，随着细胞密度到8×cells/ml，培养液上清中的乳酸累积含量仅至30mmol/L；并且，与陈昭烈等研究报道相似，在流加培养的后期培养阶段，控制流加策略，会观察到乳酸含量降低。此外，安芳兰等通过正交试验，对BHK21细胞培养基中的能量变化进行检测，结果显示乳酸的含量与各种营养物质的组合有关，并不是单纯随葡萄糖的浓度增加成正比。对于杂交瘤细胞的许多研究也显示，在不同的培养阶段，相同的葡萄糖浓度条件下，乳酸对葡萄糖的得率则有很大的变化。此外，乳酸的产生还和培养环境有关系。培养液的pH过高会使产生乳酸的速率增加。因此在不影响细胞生长的情况下，可以适当的降低细胞培养液的pH，以利于减少乳酸的积累。张元兴等检测丙氨酸对细胞代谢影响的试验中发现，乳酸在细胞延迟期积累较慢，在对数生长期快速积累，在稳定期和死亡期乳酸浓度保持不变。另外一个重要的有毒物质控制就是就是降低氨含量的积累。与乳酸相比，较低浓度的氨就会对细胞的生长产生抑制。对杂交瘤细胞培养研究显示，细胞培养上清液中氨的积累使细胞UDP-氨基己糖增加，影响细胞的生长、蛋白的糖基化过程及形式；同时氨抑制谷氨酰胺代谢途径，使天冬氨酸和谷氨酸的消耗增加，影响细胞的氨基酸代谢；此外，氨浓度的提高改变了细胞内局部微环境，影响细胞的正常生理功能。氨的主要来源是谷氨酰胺的代谢，要想降低氨的含量，需优化谷氨酰胺的代谢。由于谷氨酰胺的热稳定性差，降解速率和谷氨酰胺浓度成正比，谷氨酰胺一降解，就会产生氨。一般的普通商用细胞培养基中谷氨酰胺的浓度是4mmol/L，在批培养的过程中谷氨酰胺产生的氨大约占20%；另一方面，谷氨酰胺的浓度在0.5mmol/L～1mmol/L时，细胞的生长速率就能达到最大值；并且谷氨酰胺的消耗将随着浓度的增加而升高。谷氨酰胺在低浓度水平条件下，其代谢主要是经过谷氨酸脱氢酶的途径反应生成a-酮戊二酸进入三羧酸循环，提高了谷氨酰胺的利用率。因此，可将谷氨酰胺的浓度控制在一个较低的水平，既不影响细胞的生长又能降低氨的产生。但是不同的细胞株对乳酸和氨的敏感性具有一定差异，具体以细胞株自身的特性，结合试验结果进行细胞培养基的优化。此外，其他一些代谢废产物如丙氨酸，是细胞代谢后产生最多的氨基酸，它是葡萄糖和氨基酸代谢的中间产物，它的形成途径有两种：丙氨酸与氨结合生成及谷氨酰胺等氨基酸经转氨酶作用生成。丙氨酸可在一定条件下在丙氨酸转氨酶的作用下生成丙酮酸。研究显示，丙氨酸对细胞的代谢有一定的影响，初始细胞培养基中丙氨酸的浓度高，在一定程度上能够抑制谷氨酰胺等氨基酸的代谢，进而可能影响产品的生成。通过细胞培养基的优化在减少代谢副产物的积累上有一定的成效，但是由于不同细胞株具有一定的代谢特异性，在维持葡萄糖等低水平时并不能减少乳酸的积累，并且由于营养物质含量低还可能对产物有影响。现在一些研究者采用代谢工程技术，通过调控代谢过程中的某一个生化反应、或是利用基因重组技术引入一个新的生化反应，来调控细胞的代谢途径，进而改变细胞的代谢特性。如通过引入丙酮酸羧化酶基因，促进丙酮酸进入三羧酸循环，或是抑制乳酸脱氢酶的表达以达到减少乳酸积累的目的；也可将谷氨酰胺合成酶的基因导入细胞，使细胞自身具有合成谷氨酰胺的能力，减少氨的积累，这种方法在工业化中已有广泛的应用。
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