之前的文章里我们分享了如何分离获得小鼠的原代BMMs细胞，今天和大家分享要如何将BMMs细胞高效率的诱导分化为成熟的多核破骨细胞。
一、试剂准备：
1.细胞生长培养基：α-MEM培养基+10%FBS（澳洲胎牛血清）+1%双抗+2mML-谷氨酰胺。
2.M-CSF：用生长培养基溶解为25ng/μl，20μl/管分装后-80℃保存。
3.RANKL：用生长培养基溶解为50ng/μl，20μl/管分装后-80℃保存。
二、分化诱导：
1.参考之前的推文提取小鼠的原代BMMs细胞。
2.在BMMs细胞分化1-3天后（时间依据个人实验目的进行调整，如果细胞用于转染可适当延迟培养时间，但BMMs分化不要超过3天，3天后的BMMs细胞将被过度激活不再具备向破骨细胞分化的能力）。
3.配制分化诱导液：细胞生长培养基+25-ng/mlM-CSF+50-ng/mlRANKL，注意诱导液需要现配现用。M-CSF和RANKL的使用浓度需根据预实验进行摸索调整，不同公司的细胞因子活力相差很大，避免广告嫌疑在这里就不推荐试剂公司了。如需知道具体哪家公司的细胞因子活力好，请给我留言。
3.用PBS清洗BMMs细胞一次，完全吸弃PBS。
4.小心沿培养板壁加入分化诱导培养基，培养箱内培养48h，此后每2天换液一次。
5.分化过程：
（1）一般分化第1天会有大量的细胞变园脱落，这些细胞并不是死细胞，而是分化形成了前破骨细胞。
（2）分化第2天同样会有很多细胞变园脱落，属于正常现象，但可以观察到贴壁的部分细胞体积变大，开始膨胀融合，高倍镜下可以观察到有部分细胞出现了多核细胞核，一般2-3个。
（3）分化3-4天，细胞开始大量融合，并形成多核的破骨细胞，此时可进行TRAP染色鉴定。因细胞因子的活力差异，活力好一般3天就可以分化成功，可适当降低因子浓度，如果活力差可延长分化时间至6天，或提供细胞因子浓度。
图1.破骨细胞分化第4天形成的多核破骨细胞
注意事项：BMMs细胞的状态和细胞因子的活力是影响破骨细胞分化效率最重要的因素。培养基和血清的质量也会对分化产生一定的影响。稳定的分化条件一定的要经过多次预实验才能确定，本文的分化步骤仅供参考，不同实验室做出来效果不一，如有疑问欢迎留言交流。
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