前言
近日，医院樊嘉院士、复旦大学朱棣研究员、医院徐泱副教授作为共同通讯作者，在CancerDiscovery(IF:39.)杂志发表了题为的研究论文，报道了干扰素-α通过糖代谢重塑肿瘤免疫微环境激活免疫应答，克服免疫检查点阻断治疗（ICB）耐药，并提出两者联合治疗肝癌的新策略。
医院胡博主治医师、喻敏成博士、马晓路技师、孙嘉磊博士、复旦大学药学院刘成龙为论文的共同第一作者，文章中转录组测序及分析服务由欧易生物完成。
研究背景
肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的第三大原因，抗PD-1/PD-L1抗体是目前HCC患者进行ICB治疗的主要药物之一。与此同时，IFN-α被认为是潜在的肿瘤治疗药物，可以直接阻断细胞周期进程和诱导细胞凋亡，进而抑制肿瘤扩张。近些年的研究确定IFN-α和抗PD-1抗体是一种很有前途的治疗策略，也表明基于IFN-α的联合治疗ICB的潜在价值。尽管如此，IFN-α与ICB协同的机制以及IFN-α与ICB联合是否有利于HCC仍不清楚。
研究内容
本研究根据临床数据发现联合IFN-α与抗PD-1抗体可显著缩小部分肝细胞肝癌患者的肿瘤体积，并对抑制肝癌肺转移有明显效果。为探究背后的分子机制，构建小鼠原位和自发肝癌模型发现联合治疗组极大地抑制免疫健全小鼠肝癌进展。随后运用高通量质谱流式分析不同治疗组肿瘤微环境，锁定CD27+CD8+T细胞。通过RNA-seq进一步探索CD27+CD8+T细胞浸润的分子机制，发现IFN-α重新编程HCC肿瘤微环境中的葡萄糖代谢，从而使T细胞细胞毒性能力释放并增强了PD-1阻断诱导的免疫应答。这些研究结果表明，IFN-α和抗PD-1联合治疗是HCC患者的有效新型组合策略。
研究路线
研究结果
不可切除HCC患者对基于IFN-α的抗PD-1免疫联合治疗有显著的临床反应
本研究观察了15例不可切除HCC患者接受基于IFN-α的抗PD-1免疫联合治疗的疗效，ORR达到80%（图1A-B）。同时发现联合治疗可显著缩小部分HCC患者的肿瘤体积，并对抑制肝癌肺转移有明显效果（图1C-D）。随后使用流式细胞术在15例接受联合治疗的患者外周血中检测到CD8+T细胞的富集（图1E-F）。这些发现共同支持不可切除HCC患者对基于IFN-α的抗PD-1免疫联合治疗有显著的临床反应。
图1
IFN-α增强基于抗PD-1的免疫治疗在HCC中的疗效
IFN-α治疗增强了抗PD-1抗体在小鼠HCC模型中的疗效
为了探讨联合治疗疗效提高的机制，构建了小鼠原位移植瘤模型和自发性肝癌模型。在小鼠原位和自发性肝癌模型中，联合治疗比单独IFN-α或抗PD-1治疗促使更大的肿瘤消退，总生存率也显著提高（图2A-E）。同时也观察到联合治疗可导致严重的肿瘤坏死和肺转移灶完全消除（图2F-G），而这一治疗效果在清除小鼠体内CD8+T细胞后完全消失（图2H-I）。总之，这些研究结果进一步验证了IFN-α增强了抗PD-1抗体治疗HCC的临床疗效。
图2
IFN-α增强抗PD-1免疫疗法的疗效并改变肿瘤微环境的免疫格局
高维分析显示，抗PD-1联合IFN-α治疗后CD27+CD8+T细胞富集
鉴于癌症免疫治疗主要取决于T细胞浸润肿瘤微环境，接下来进一步评估哪种T细胞群有助于改善联合治疗的抗癌效果。结果发现IFN-α和抗PD-1抗体联合治疗以CD8+T细胞依赖的方式消除肿瘤细胞（图3A-B），通过质谱流式和多色免疫荧光分析发现联合治疗小鼠的肿瘤组织中CD27+CD8+T细胞亚群的浸润程度显著升高（图3C-F）。公共HCC数据集的单细胞测序数据分析也佐证上述观点（图3H-J），同时在CD27高表达的CD8+T细胞中，PD-1的表达也升高（图3K-L）。因此推测CD27+CD8+T细胞亚群介导了联合治疗的抗肿瘤作用，而CD27是CD8+T细胞效应功能的关键因素。
图3
通过CyTOF深入鉴定T细胞室
IFN-α通过抑制HIF1α诱导的HCC糖酵解增强抗PD-1功效
为了进一步阐明IFN-α增强抗PD-1疗效的机制，通过RNA-seq技术确定抗PD-1治疗后的小鼠原位肝癌细胞（Hepa1-6）转录改变。GSEA分析表明肿瘤细胞经联合治疗后，HIF1α信号通路明显受到抑制（图4A-B）。通过ECAR实验、流式细胞术、HIF1α敲除等系列的体内外实验发现，单独抗PD-1处理肝癌细胞展现出极强的糖酵解能力，而干扰素正是通过纠正“肿瘤-免疫微环境”之间糖代谢竞争失衡发挥作用（图4D-Q）。综上所述，IFN-α可以通过抑制肿瘤细胞的HIF1α信号，增强CD8+T细胞的HIF1α信号和细胞活性，有效提高HCC的抗PD-1治疗疗效。
图4
HCC细胞中HIF1α信号异常激活以改变T细胞糖酵解状态，而IFN-α治疗可恢复T细胞的细胞毒性能力
IFN-α以IRF1依赖的方式抑制FosB的表达，调节抗PD-1治疗后HIF1α信号
为了探究HIF1α信号在上述过程中调控的分子机制，通过RNA-seq技术检测Hepa1-6细胞在接受治疗后的差异表达基因，根据表达和功能锁定FosB分子（图5A）。通过co-IP、CHIP-qPCR实验发现，FosB可与HIF1α互作，沉默FosB显著降低了HIF1α对其糖酵解相关靶点基因的表达（图5D-I）。同时，通过挽救实验证实了IRF1在IFN-α调控的FosB表达中发挥作用（图5L-N）。总之，这些数据表明IFN-α以IRF1依赖性方式来抑制FosB表达，从而削弱HIF1α介导的糖酵解作用。
图5
IFN-α通过抑制IRF1依赖型中FosB转录来抑制HIF1α信号传导
高糖微环境通过mTOR诱导的FOXM1表达促进CD27转录
有报道mTOR信号有在微环境中感知葡萄糖和调节T细胞糖酵解的重要作用，本研究发现在高糖环境下，mTOR信号在调节CD27表达中发挥重要作用（图6A-B）。之后使用公共的单细胞测序数据，发现FOXM1在CD27高表达细胞中有显著表达（图6C）。体内外实验均证实联合治疗的CD8+T细胞显示出FOXM1的高表达（图6D-F）。随后通过FOXM1敲除实验和免疫印迹分析，确定mTOR-FOXM1-CD27的上下游关系（图6G）。这些数据证实了高糖微环境可以触发mTOR信号激活，导致FOXM1过表达和随后的CD27的转录。
图6
HCC细胞中HIF1α信号异常激活以改变T细胞糖酵解状态，而IFN-α治疗可恢复T细胞的细胞毒性能力
CD27+CD8+T细胞与基于PD-1治疗的免疫应答和HCC的存活相关
使用临床数据结合TCGA数据进行预后分析，发现CD8或CD27高表达的HCC患者预后明显优于低表达（图7A-B）。通过多色荧光实验和单细胞测序数据分析，CD27+CD8+T细胞亚群与抗PD-1治疗患者的免疫应答相关（图7C-D）。总之，这些数据证实CD27+CD8+T细胞与HCC患者生存率和接受PD-1阻断免疫治疗的HCC患者的免疫应答相关。
图7
CD27+CD8的组合在基于抗PD-1疗法治疗多种癌症类型中有良好的预后预测能力
研究结论
（1）肿瘤糖代谢在IFN-α介导的HCC抗肿瘤免疫中发挥作用；
（2）肿瘤浸润性CD27+CD8+T细胞可用于抗PD-1治疗分型的生物标志物；
（3）IFN-α和抗PD-1联合治疗是HCC患者的一种有效的新联合策略。
参考文献：
HuB,YuM,MaX,SunJ,LiuC,WangC,WuS,FuPY,YangZ,HeY,ZhuY,HuangC,YangX,ShiY,QiuS,SunH,ZhuAX,ZhouJ,XuY,ZhuD,FanJ.Interferon-apotentiatesanti-PD-1efficacybyremodelingglucosemetabolisminthehepatocellularcarcinomamicroenvironment.CancerDiscov.Apr12:candisc...doi:10./-.CD-21-.
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