细胞培养是合成生物学的一个基础，我们可以通过对细胞的信号通路施加特异性的影响来观察可能的效应。细胞培养是基于细胞全能性发展起来的细胞生物学技术，可以有克隆：无性繁殖；以及植物细胞培养---转基因植物；动物细胞培养---转基因动物。当然，这可能与微生物的培养相比不能更为直接地生产我们需要的产物，但将外源目的基因转入植物的细胞、组织、器官中，同样能够获得满足需要的动/植物。当然我们也可以通过其他的发生如基因敲除，miRNA导入，药物处理等等来施加处理。
在体外对细胞培养并进行研究的技术,也叫细胞克隆技术.细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。
细胞培养的优点
1.得到的是活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动
2.可控制：可控制-选择对象：类型：上皮？间质？；性质：正常？肿瘤？可控制-调节条件：各种因素:物理、化学、生物等因素
可控制-利用方法：采用各种研究技术、记录方法：研究：倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交，同位素标记--记录：摄影照片、缩时电影、电视—
3.应用广：
学科多：
对象广：各种动物：低等动物--高等动物--人类一种动物：不同年龄
不同组织:正常或异常（肿瘤）
4.较经济
花钱较少但可得到大量、同时、重复性好的生物学性状相似的实验对象
5.不易污染环境
缺点
1.现人工无法完全模拟体内环境a.失去彼邻关系b.失去神经体液的调节和细胞相互间的影响
2.细胞趋向单一化
3.失去原有组织结构和细胞形态
4.分化减弱或不显：要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。
5.某些类型细胞还很难培养
6.大规模培养难度大
培养的方式
1.粘附型培养:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。粘附是大多数有机体细胞在体内外生存和生长发育的基本存在方式
2.悬浮型培养:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。
来源:来自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞.癌肿细胞也可以.
特点:在悬浮中生长良好,细胞圆形，单个或小细胞团
优点:生存空间大，提供数量大,传代方便(不需消化),易于收获可获得稳定状态.
缺点:观察不方便,很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)
根据形态大致的不同，主要2类：上皮样，成纤维细胞样，其它，不定型
上皮样：来源：来源于外胚层，内胚层细胞如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤。形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核
成纤维细胞样细胞：来源：中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮
形态：似体内成纤维细胞的形态，，中有卵圆形核
o1.细胞系（cellline）：原代培养物首次传代后，就可以称细胞系。不能或有限传代下去称有限细胞系。能连续传代的称连续细胞系。
o2.细胞株：某类细胞经传代克隆并保持了该类细胞理化特征的细胞群体。
o3.原代培养：直接取自生物体的组织细胞并进行培养。
o4.传代培养：将细胞从一个培养物内分散到另一个培养物的过程。
o5.转染（transfection）：将某个基因转移到培养细胞核内。
o6.lipofection：常用细胞转染剂（脂质体），它搭载基因（DNA）后形成复合物可转染到动物细胞。
常用设备
1.超净工作台；
2.纯水装置；
3.抽气泵；
4.消毒装置；
5.干燥装置；
6.CO2培养箱(孵箱)；
7.液氮生物容器；
8.冰箱；
9.离心机
10.天平
11.显微镜
12.过滤装置
13.空调
14.酸度计
15.干燥器
常用消耗器材
1.培养瓶及各种相关玻璃用品、塑料用品和棉制品
2.手术器材
培养用液
1.天然培养基（液）：血清、鸡胚浸出液、鼠尾胶
2.人工合成培养液：合成培养基、平衡盐溶液、缓冲液、蒸馏水、消化液和抗菌素等
一、原代培养基本技术
取材→漂洗→剪切→消化→计数→接种
二、传代培养技术
去旧换新液→消化→分装
三、细胞冻存及复苏技术
每代细胞基本的生长过程
一.游离期：细胞接种后最初一段时间,细胞在培养基中呈悬浮状,胞体圆形.
二.贴壁期：细胞附着于支持物上
三.潜伏期：细胞活着但无分裂.细胞株6—24h；原代24—96h
四.指数增长期：细胞增殖旺盛,数量成倍增多,最适合实验研究.3—5d以后来到.
五.停止期(衰退期)：细胞长满瓶壁,有活力,不增殖,能存活一段时间.如传代进入下一循环.
o细胞群体倍增时间:指细胞在培养条件下生长时其数目倍增所需的时间。
o细胞分裂指数:细胞群体中分裂细胞所占的百分比
o五、分子生物学
o1.DNA分离、分析
o2.基因导入
o3.基因表达的原位检测
o六、生物技术
o1.疫苗的制备
o2.细胞工程抗体
o七、药物开发
o药理、毒力和药效试验
o八、细胞分化
o如干细胞研究
o九、肿瘤学研究
o发生、发展、浸润、转移和转化等
o十、细胞衰老、凋亡
1.体外培养的细胞按生长方式可分为哪二种?按细胞在体外生长的形态特征,可分为哪几种常见类型?⑴按生长方式分为二型：粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。（绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。）⑵可分四型：(1)上皮型细胞(2)成纤维型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞
2.简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程
⑴通常，体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段：①原代培养期：也称初代培养，是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。②．传代期：通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系。一般情况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。③衰退期：处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。以上特点，主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性或恶型性的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系或连续细胞系。
⑵每代贴附生长细胞的生长过程：①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。时间：10分钟一4小时②贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等③潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。⑤停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度限制
3.简述体外培养细胞对生存环境的基本要求.
⑴细胞的营养需要：①基本营养物质：氨基酸（１２种＋谷氨酰胺）、维生素、葡萄糖、核糖、脱氧核糖等无机离子。②促细胞生长因子：多由血清提供
⑵细胞的生存环境：①温度条件对细胞生长的影响：不同生物来源的组织细胞培养温度不同；体外培养动物细胞最常用的温度是37℃，耐低温不耐高温。在生理温度范围内，温度与细胞生长率之间存在正相关关系。②气相环境对细胞生长的影响：动物细胞培养的气相环境都是采用5%CO2与95%空气（提供氧）的混合气体。Ｏ2参与细胞的能量代谢过程，ＣＯ2用于维持培养液的酸碱度，一般多为开放式培养③培养液的酸碱度对细胞生长的影响：大多数的有机体细胞能在pH6.0～8.0的环境中生存。最适宜的pH值范围是7.2～7.4。体外培养的正常细胞耐酸能力要强于耐碱能力④无污染、无毒。
4．什么是细胞培养用液,主要分为哪几类?
⑴培养用液是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液。⑵主要包括：平衡盐溶液；培养基；其他培养用液。
5．D-Hank’s与Hank’s的主要区别是什么?D-Hank’s不含有Ca2+、Mg2+，常用于配制胰酶溶液。
6．简述胰酶的常用浓度及配制时的注意事项。
胰酶(trypsin)溶液：浓度一般为0.1％～0.25％，配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液。
7.细胞培养中血清的主要作用？
(1)提供基本营养物质；(2)提供贴壁和扩展因子(3)提供激素及各种生长因子；(4)提供结合蛋白(5)对培养中的细胞提供某些保护作用
8.血清的使用与储存有哪些注意事项？
（1）使用前的处理：使用前通常在56℃加热30分钟，这一过程称为灭活。热灭活目的：灭活血清中的补体成分。对于一些品质高的胎牛血清和新生牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。
（2）储存条件：血清一般储存于－20℃,同时应避免反复冻融。大包装的血清，首先将血清灭活处理，然后分装为小包装，如10ml、20ml、50ml，储存于-20℃，使用前融化。融化后的血清在4℃不宜长时间存放，应尽快使用。
9.简述干粉培养基的配制过程。
DMEM培养液的配制（举例）：⑴mLddH2O于mL烧杯中，将DMEM粉1包倒入其中，盛粉袋用50mLddH2O分次冲洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）搅拌溶解。⑵用5％－10％的NaHCO3调pH至7.2。⑶加青、链霉素至终浓度u/mL和ug/mL⑷用0.22um的滤膜过滤除菌。⑸分装（mL左右）后4℃冰箱保存。
10.细胞培养工作室可分为那几个部分，各有什么作用?
一般包括：准备室、培养室和缓冲室。作用：⑴准备室：用于进行培养器皿的清洗、包装、培养物质的准备和消毒以及供应物品的保藏等。⑵培养室：用于进行细胞培养和各种无菌操作的实验室。其基本条件是：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。天花板不宜高过2.5M。⑶缓冲室：（更衣室）
11.CO2培养箱的作用及使用中的注意事项。
用于维持适当温度、湿度与pH。注意事项：⑴质量关键在控温装置，温度变化一般不应超过0.5度;培养箱的温度设在35～37℃，这是人和哺乳动物培养细胞的最适温度。⑵培养容器需与外界保持通气状态。⑶箱内空气应保持干净，定期消毒（紫外灯、酒精）⑷水槽:保持一定湿度
12.试述清洁液的配方组成及配制时的注意事项。
⑴清洁液:重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml），强清洁液63∶∶，次强清洗液∶∶，弱清洁液∶∶⑵配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸，并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色
13．简述消毒灭菌的常用方法、要求条件及主要应用范围。
⑴物理消毒灭菌法①紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿。消毒时间：30min（至少）；紫外杀菌功能除了紫外本身以外，还可以由产生的臭氧来完成。紫外灭菌以后，最好过一个小时再进去。②过滤：0.22μm（适用于液体）③湿热（高压蒸气灭菌法）15磅,℃，20min各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要求如下：培养用液、橡胶制品l0磅l0分钟布类、玻璃制品、金属器械等15磅20分钟④干烤：℃,2小时（适用于玻璃器皿等）注意：消毒后不要立即打开箱门，以防冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。⑵化学消毒灭菌法：①7５%酒精主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。②1－２‰新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。③抗生素主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。细胞培养中最常用的抗生素是青霉素（常用浓度是u/ml）与链霉素（μg/ml）。不要在原代培养中加入抗生素。
14.如何对玻璃器皿进行有效清洗？
玻璃器皿的清洗：浸泡—刷洗(+烘干)—浸酸—冲洗；清洗后的玻璃器皿：干净透明无油迹。⑴浸泡：①初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。②新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。③再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的残留蛋白质，干固后不易洗掉，用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。⑵刷洗：用毛刷（特制的羊毛刷）沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。自然晾干或烘干后泡酸。⑶浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液（洗液）中。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间：一般为过夜，不应少于6小时。⑷冲洗：在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗,使之尽量不留污染或清洁液的残迹。最好用洗涤装置。如用手工操作，需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，然后用蒸馏水清洗3-5次，晾干（或烘干）备用15．细胞培养中最常用的抗生素及使用浓度是什么?青霉素（常用浓度是u/ml）与链霉素（μg/ml）。
16．什么是原代培养？简述原代培养方法的分类及主要操作步骤。
⑴原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称原代培养。⑵原代培养方法分类：贴块法和消化法。消化法又分为冷消化与热消化；一次性消化与分次消化。主要步骤：贴块法：将取得洗净并剔去多余成分的组织切成约1mm3大小的植块，用于植块培养。消化法：将取得洗净并剔去多余成分的组织剪碎——蛋白酶溶液消化——机械方吹打组织块—对滤过液离心（r/min,10min）——用培养液悬浮成细胞悬液——计数并调节细胞密度——用于分离细胞培养
17．何谓传代培养？简述贴壁细胞的传代操作步骤。
⑴传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。⑵贴壁细胞传代培养：①选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的D-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。②加入适量0.１％－0.25％胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。③用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。④以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃CO2培养箱培养。⑤观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。
18．收集细胞时一般常用的转速和时间是多少？转速：r/min；时间：5min
19.什么是冷冻保存？影响细胞冷冻保存效果的因素有哪些？⑴冷冻保存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在加有冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-70℃的超低温条件)，并在此温度下对其长期保存的过程
⑵①冷冻速率当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。②冷冻保存温度：液氮温度(-℃)是目前最佳冷冻保存温度。应用-70℃～-80℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。③复温速率指在细胞复苏时温度升高的速度。一般来说复温速度越快越好。常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内完成复温。在冷冻复苏中遵循：慢冻速溶原则。④冷冻保护剂：是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。分为：渗透性：常用甘油、DMSO非渗透性甘油或二甲基亚砜这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。保护机制：是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和DMSO并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让甘油或DMSO等充分渗到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前，DMSO的应用比甘油更为广泛。非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质。
20．冻存的细胞一般如何复苏？1)将恒温水浴箱的温度调至37～40℃。2)从液氮中取出冻存小管，立即投入37～40℃温水中快速晃动，直至冻存液完全融解。要在1～2min内完成复温。3)将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5m1培养液，轻轻吹匀。4)将细胞悬液经～r/min离心5min。弃上清液。5)给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀。将细胞悬液移入培养瓶内，加足培养液进行培养。21．简述培养细胞的非玻璃化冻存过程。非玻璃化冻存——是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70～-80℃，然后投入液氮进行保存；该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。冻存过程：(1)待冻存细胞悬液的准备：①按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物,制备成单细胞悬液,计算细胞总数。②将细胞悬液以～r／min离心5min，弃上清液。③向沉淀物中加入冷冻液。轻轻吹吸均匀，使细胞密度达1×～1×个/ml。④按每管1～1.5ml的量，分装于冻存小管内。拧紧管盖。⑤在冻存小管上做标记，包括细胞代号及冻存日期。(2)分级冷冻：①先将冻存小管放人普通冰箱冷藏层(4～8℃)，约40min。②接着置于普通冰箱冷冻层(-10～-20℃)，30～60min。③再于-30℃放置30min左右（可省略）。④然后在-70～-80℃下过夜。⑤最后将冻存小管投入液氮保存。还有一种简单的方法，就是将冻存小管先悬挂在液氮罐口20min，再直接投入液氮中保存。第三种方法是，用4℃预冷的冷冻保护液悬浮细胞，分装冻存小管后，将冻存小管放在4℃下30min；然后置于壁厚1cm以上的泡沫塑料小盒内封好，立刻将小盒放置在-70～-80℃冰箱中24h以上至1周；再将冻存小管投入液氮中保存。(3)记录：做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及冻存经手人。22．DMSO使用时应注意哪些事项？⑴在使用DMSO前，不需要对其进行高压灭菌，因其本身有灭菌作用。⑵在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制冷冻保护剂时最好带手套。⑶由于许多冷冻保护剂(如DMSO))在低温条件下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温融解后要及时洗除冷冻保护剂。
23.细胞培养中常见有哪些微生物污染，有何主要特征？⑴真菌污染：真菌种类多，形态各异，但污染后均不难发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下观察呈丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌呈卵圆形态，散在于细胞周边和细胞之间生长。⑵细菌污染：污染后大多能改变培养液pH培养液变混浊，毒性大的细菌很快导致细胞崩解死亡。加用抗生素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。⑶支原体污染：支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的一种污染。
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