2.3病毒的筛选和敏感性适应提高病毒表达量已是当前提高产率的一个技术要点，也是降低成本、提高生产竞争力的关键之一，除提高细胞密度和筛选优良细胞株外，作为种源的毒株也应进行相应的筛选优化。传统观念认为疫苗菌株的选择应该是抗原性越接近地方性野生菌株越好，但这一观念在工业化的生产中难以推行，原因有以下几点：首先，许多地方性菌株或是野生菌株难以适应通用的宿主（组织或细胞），在该宿主上其敏感性可能不稳定，或者是适应后抗原性发生变化；其次，野生毒株的工业化适应过程、检测过程及审批过程所需的时间很长；第三，一些标准毒株的免疫力及保护范围要明显高于其他毒株。因此，对于一株野生毒株的适应是一个较为艰巨的任务，对于工业化生产来说，选择标准毒株能够明显缩短时间。毒株对细胞的敏感性适应非常重要。但在实际应用中，选定毒株以后，不但毒株本身对细胞的敏感性差异性较大，并且工艺的革新等使得毒株对宿主细胞的敏感性也可能会发生变化，因此，工业化中选择标准病毒菌株的同时，由于对宿主细胞的敏感性不同或是生产工艺变化，需要对病毒进行相应的适应、驯化。2.3.1病毒株的宿主细胞筛选同一病毒株可能对多种宿主敏感，但不同的宿主采用的工业化生产方式可能不同，选用合适的宿主细胞是提高生产效率及简化生产工艺的前提。对此，最明显的一个案例是人用狂犬病毒宿主细胞的适应选择。从年巴斯德尝试用感染狂犬病毒固定毒的兔脊髓经室温干燥后制备疫苗，该疫苗应用于人试验并获得了成功，为狂犬疫苗的制备奠定了基础，随后又将病毒培养宿主发展到了脑组织。年Wiktor在Wistar将狂犬病毒PM毒株适应到人二倍体细胞株上，年获得批准生产，年开始商业化生产。但是由于人二倍体细胞（HDC）不容易培养，而且狂犬病毒在HDC上培养的病毒滴度相对较低，仅能在空间有限的细胞瓶内培养，这使得疫苗的价格非常昂贵，限制了该疫苗在发展中国家的使用。VanWezal等在年又将狂犬病毒PM株进一步适应到狗肾细胞（MDCK），并使用微载体悬浮培养工艺进行疫苗的大规模生产。年法国Merieun研究所成功适应了PM株在Vero细胞上增殖，与采用HDC相比，不但Vero细胞能生产较高的狂犬病毒滴度，而且Vero细胞易于培养且能借助微载体采用悬浮培养技术进行工业化规模生产，使得狂犬疫苗的生产率明显提高且综合成本明显降低。同一病毒株可对多种宿主细胞敏感，但是其敏感性可能会不同，其敏感性、安全性等受多种因素影响，如宿主细胞、培养方式、细胞培养基等。魏风等年对犬瘟热病毒（CDV）在鸡胚成纤维细胞、MDCK细胞及Vero细胞上增殖特性的试验显示，CDV在3种细胞中均能增殖，并均产生明显病变，但是在Vero细胞上增殖时，不仅病变时间早，病变明显，而且病毒毒价比在MDCK细胞和鸡胚成纤维细胞高；但是如果根据不同细胞的特性进行培养条件优化后，培养的病毒毒价也可能发生变化，这样就需进一步的研究。樊庆帅等在年采用不同的细胞培养基培养MDCK细胞生产狂犬病毒的结果显示，无血清培养基的病毒滴度高于含血清的培养基，同样采用无血清无动物来源细胞培养基培养MDCK细胞生产猪回肠炎疫苗，犬瘟热、腺病毒、细小病毒、副流感病毒2型呼吸道感染症四联疫苗等，培养的效果明显优于含血清的培养液。因此，对于如何为病毒选择合适的宿主细胞，通常根据毒株特性，综合考虑所用毒株能在何种宿主细胞上增殖、表达，该细胞是悬浮细胞还是贴壁细胞，是否能够适合大规模培养，采用的培养工艺是否发生变化，该变化是否会影响表达的稳定性，随着工艺及环境变化，如果毒株对宿主细胞的敏感性发生变化，能否通过病毒的适应使其敏感性恢复或是增加等。因此，病毒在对宿主细胞的适应筛选过程中，工艺及环境对其影响因素较多，相应的适应工艺复杂且工作时期较长，此过程中采用合适的适应驯化技术较为重要。2.3.2病毒的适应驯化同一细胞不同培养方式或是细胞培养基不同，病毒量、免疫源性、毒力等也可能不同。当选定的病毒株对一些细胞基质不够敏感时，通过传代适应、驯化的方式，使病毒逐步适应该细胞基质，最终达到一定的滴度，满足生产疫苗及提高生产效率的需求。在当前的工业化大规模动物细胞悬浮培养生产工艺中，由于培养工艺的改变，宿主细胞生长方式的改变，其代谢途径可能发生变化，导致病毒对其敏感性发生变化。例如，大多数口蹄疫病毒株对BHK21细胞的敏感性在转瓶中贴壁培养时高于生物反应器中悬浮培养方式，为提高表达效率，需对病毒的敏感性进行相应的适应驯化；同样，兽用狂犬病毒对BHK21细胞的敏感性随着生产工艺的改进也进行了相应的适应，20世纪90年代后，巴斯德研究所革新工艺，采用生物反应器悬浮培养BHK21细胞生产兽用狂犬病毒，并使用无血清细胞培养基，经过狂犬病毒株对宿主细胞的适应驯化，获得的疫苗在小鼠体内具有良好的免疫原性和耐受性，最终使得生产工艺简单，成本得到降低。病毒的适应方法通常是采用病毒传代驯化法，即将预驯化的病毒接种到相应的宿主细胞上，收获后利用收获液继续感染该细胞，如此重复传代，直到病毒适应该细胞。在适应的过程中检测其免疫原性是否发生变化，是否受外源病毒污染等，然后建立工作种毒库。在此以口蹄疫病毒对BHK细胞的敏感性适应为例，将转瓶生产用病毒适应到悬浮培养方式，其驯化及建库程序如下：1)将病毒接种在单层BHK细胞上，待发生快速病变时（如过夜），将病毒收集；2)将收集的病毒传代至悬浮培养的细胞上，收集悬浮培养的病毒作为种毒继续传代，直到病毒滴度达到要求；3)建立原始种毒库和母种毒库；4)检测母种毒库免疫原性是否发生变化，并检测是否有外源物质污染；5)从母种毒库建立工作种毒库并在-70℃至-80℃条件下保存；6)工作种毒滴度检测以后，可以制定固定的病毒感染复数（MOI）。
年PierrePerrin等采用该方法，将已适应单层转瓶培养BHK21细胞的狂犬病毒株，成功驯化适应至无血清悬浮培养的BHK21细胞株，在反应器中经过3次传代驯化，病毒滴度明显提高（见下表2-2），且收获的时间明显提高。
表2-2驯化PV-Paris/BHKvirusstrain病毒株适应无血清反应器悬浮培养的BHK21细胞株的结果
金宇集团通过不断的适应和驯化，实现口蹄疫病毒株在悬浮BHK21细胞株上的稳定表达后，并通过不断的悬浮驯化适应技术，接种病毒比例为2-8%，获得的病毒s含量可达6.8ug/ml。因此，病毒及其宿主细胞培养的方式发生改变，病毒的滴度也可能发生变化，与更换宿主细胞相比，进行病毒的驯化适应是一个较易成功的选择。
此外，接种病毒时，确定合适的接种细胞密度和病毒感染复数有利于提高生产效率和降低生产成本。优化培养工艺的其中一个目标就是在获得最优细胞密度的同时，代谢产物的堆积不影响病毒的增殖，并利于病毒的高效表达。传统观念认为，病毒产量和细胞的密度成正比，生产时追求细胞高密度培养，但是在实际生产中，高细胞接种密度需要的细胞培养时间长、种毒量大，造成人力、物力及时间的无效浪费，提高了整体生产成本。目前也有大量调查研究报告证实：采用个性化细胞培养基（低血清或无血清细胞培养基）全悬浮培养BHK21细胞时，根据细胞培养基和细胞株性能，细胞密度可达cells/ml以上，但是用来生产口蹄疫病毒时采用批培养技术，随着细胞密度的增加，细胞代谢副产物和毒素也在不断的积累升高，细胞培养基的有效利用率降低，对病毒效价也可能会有负面作用，因此，细胞生长至适当密度即可接种病毒；Kallel等在BHK-21细胞感染狂犬病病毒具有相同的现象。但是生产工艺的不同，合适的接种细胞密度也不同。如果采用微载体培养贴壁细胞生产分泌型的产品，例如采用微载体培养ST细胞生产猪瘟病毒，一定条件下细胞密度与微载体的密度成正比，采用流加或是灌注培养工艺，病毒产量与病毒一定条件下成正比，但是工业化生产需要考虑微载体的成本。在工业化生产中，追求高的生产效率时病毒和细胞的适应及浓度控制是其中一个工艺关键技术。
由于每种病毒感染细胞的滴度不同，每种疫苗所需要的病毒量（免疫原）也不同，所以目前对于疫苗毒种的滴度要求没有统一的尺度，不同的疫苗有不同的标准。例如目前已上市的疫苗中，麻疹减毒活疫苗毒株的滴度要求为≥4.5LgTCID50/ml，乙型脑炎减毒活疫苗毒株的滴度要求为≥7.2LgPFU/ml。因此，对细胞基质敏感性的评价不仅仅是结果，其在细胞基质上适应的全过程同样重要。病毒对细胞基质的敏感性直接影响疫苗的产量，只有达到规模化生产，才有生产疫苗的可能，才能起到预防传染性疾病的作用。
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