宋增福1,2,吴天星3,潘晓东1,2
(1.浙江大学动物科学学院,浙江杭州 ;2.浙江大学宁波理工学院分子设计与营养工程实验室,浙江宁波 .浙江大学理学院,浙江杭州 )
[收稿日期] [文献标识码]A [文章编号]() [中图分类号]Q.9
[摘要]本试验以鱼肠道上皮细胞为模型,以肠道的致病鳗弧菌为对照,研究了丁酸梭菌对鱼肠道上皮细胞的黏附作用及黏附对细胞的损伤和成活率的影响。结果表明∶丁酸梭菌对鱼的肠道上皮的黏附率为7.39±1.85,低于鳗弧菌的黏附率(P0.05);对细胞的损伤率为1.02±0.35,显著低于鳗弧菌对细胞的损伤率(P0.05);黏附后丁酸梭菌组对细胞的成活率的影响与正常对照组比较,差异不显著;当酪酸菌、鳗弧菌与肠道上皮细胞共同培养时,使鳗弧菌的黏附率下降7.03%(P0.05)。因此,该株丁酸梭菌可以安全地黏附鱼肠道上皮细胞,并能有效抑制鳗弧菌的黏附。
[关键词]丁酸梭菌;体外黏附;抑菌作用;细胞损伤;肠道上皮细胞
黏附是细菌重要的生理活动,尤其是益生菌对致病菌的黏附抑制,可以有效地降低病原菌在肠道的增殖,从而平衡肠道菌群。丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)作为益生菌常用来防治人和动物的腹泻、肠炎等疾病[1,2]。Motomichi等[3]的研究表明,丁酸梭菌能够黏附于Caco22细胞,抑制大肠杆菌O∶H7的黏附。但是有关丁酸梭菌对鱼肠道细胞的黏附及对水产致病菌的黏附抑制的研究尚无报道。本试验以分离培养的鲫鱼肠道上皮细胞为模型,以鳗弧菌(Vibrioanguillarum)为对照,研究丁酸梭菌对鱼肠道上皮细胞的黏附作用及黏附对细胞的损伤和成活率的影响,并探讨丁酸梭菌与鳗弧菌在共同黏附肠道上皮细胞时两者之间的相互作用,为该菌在水产业的应用做初步的探索。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 仪器医用超净工作台SW2CJ22F2D,江苏安泰空气技术公司产品;电热恒温培养箱HPXMBE,上海博迅实业有限公司产品;二氧化碳培养箱,HERAcell,德国贺利氏公司产品;相差显微镜CKX41,日本奥林巴斯株式会社产品;厌氧工作站concept,英国Ruskinn公司产品;立式压力蒸汽灭菌器,YXQSII,上海博选实业有限公司产品。
1.1.2试剂MRS培养基,Harmony公司产品;DMEM和TritonX,Gibco公司产品;胶原蛋白酶Ⅰ型、Ⅳ型,Sigma公司产品。
1.1.3 试验动物鲫鱼,10g左右,购自杭州凯旋路农贸市场。
1.1.4 细菌丁酸梭菌由浙江大学宁波理工学院重点实验室保存;鳗弧菌由上海水产大学农业部渔业动植物病原库提供。
1.2 细菌的活化丁酸梭菌的冻干粉接种于装有MRS液体培养基的小三角瓶,装量90mL,放置于二氧化碳工作站,28℃,静止厌氧培养24h。鳗弧菌斜面转接三角瓶中的营养肉汁液体培养基,放置恒温培养箱,28℃,普通培养24h。血球计数板计数,调整各菌液浓度为1×CFU/mL放置4℃冰箱备用。
1.3 鱼肠道上皮细胞的培养 参照Guzman2Murillo等[4]原代培养鲫鱼肠道上皮细胞的方法,并作改进。采样前后抗生素处理鱼体,采用胶原蛋白酶Ⅰ型、Ⅳ型(Sigma公司)、EDTA,消化肠道组织,依据各细胞贴壁时间的不同纯化肠道上皮细胞。细胞培养以含5%胎牛血清的DMEM(Gibco公司)作为细胞的培养液,放置于5%的CO2培养箱中28℃培养。
1.4 细菌黏附率的测定参照Isabelle等[5]的方法,采用平板活菌计数法测定丁酸梭菌、鳗弧菌对鱼肠道上皮细胞的黏附率。将原代培养的细胞,以1×细胞/mL浓度接种于24孔培养板,放置于CO2培养箱28℃培养。待细胞呈单层生长,铺满培养板底壁后,分成两组:试验组每孔加入μL丁酸梭菌(1×CFU/mL),对照组每孔加入μL鳗弧菌(1×CFU/mL),各重复12个孔,继续培养1.5h。然后用Hanks液轻轻冲洗6次,洗去未黏附的细菌,加入含1%TritonX的PBS0.2mL于各孔,混匀置室温下10min,使其释放黏附的细菌;再加入PBS缓冲液0.8mL终止反应。吸出各孔悬液,用无菌生理盐水倍稀释,平板活菌计数法测定细菌数。细菌黏附率(%)=Triton处理后释放出细菌浓度所加入细菌的浓度×
1.5 黏附对细胞损伤的测定细胞接种培养及试验分组同1.4项,各组重复12个孔,继续培养15h。吸取各孔培养悬液,r/min离心10min取上清。用全自动生化分析仪测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量。另取鱼上皮细胞悬液1mL与含1%TritonX液1mL混匀,裂解细胞,离心取上清液测定乳酸脱氢酶(LDH),并定为最大释放量,具体方法参照文献[6]。按下式计算出丁酸梭菌和鳗弧菌黏附对鱼上皮细胞的损伤活性:
1.6 细胞存活率的测定采用台盼蓝排除检测法[7]测定细胞存活率。细胞的接种培养同1.4项。待细胞呈单层生长,铺满培养板底壁后,分3组。试验组每孔加入μL丁酸梭菌(1×CFU/mL),对照组每孔加入μL鳗弧菌(1×CFU/mL),另设正常对照组两种菌都不添加,各组重复12个孔,继续培养。在1、3、6h3个不同的时间段,各孔加入0.25%胰蛋白酶消化单层细胞,待看到细胞形态改变后,立即加胎牛血清中止,制成细胞悬液。
吸取20μL悬液和等量的2%台盼蓝液混合,滴入细胞计数板,显微镜下计数个细胞,呈蓝色的为死细胞,活细胞未着色,计算存活率。
1.7 丁酸梭菌抑制鳗弧菌黏附参照Forenstier等[8]的方法,将细胞传代于24孔培养板中培养,细胞贴壁且呈单层状生长。待细胞铺满培养板底壁后,分为2组:对照组每孔只加μL(1×CFU/mL)鳗弧菌,试验组则加入丁酸梭菌μL(1×CFU/mL)与μL鳗弧菌(1×CFU/mL)的混合液共同孵育,各组重复12孔,培养60min。
然后PBS轻洗3次,洗去未黏附的细菌,加入含1%TritonXPBS0.2mL于各孔,混匀置室温下10min,释放黏附的细菌。再加入PBS0.8mL终止反应,吸出各孔悬液,用无菌生理盐水倍稀释。营养肉汁培养基平板活菌计数法测定鳗弧菌数。
1.8数据分析试验数据以x�±s表示,采用MicrosoftExcel3处理,用t检验进行显著性的比较,显著水平设为P=0.05。
2 结果
2.1 丁酸梭菌和鳗弧菌对肠道上皮细胞的黏附率丁酸梭菌能够黏附于鱼肠上皮细胞(见表1),其黏附率为7.39%;显著低于致病菌鳗弧菌13.51%的黏附率为(P0.05)。
表1 丁酸梭菌和鳗弧菌对肠道上皮细胞的黏附率
组 别
黏附率/%
试验组(丁酸梭菌组)
7.39±1.85b
对照组(鳗弧菌组)
13.51±2.52a
注:同列数值中上标字母不同表示组间的差异显著(P0.05),上标字母相同者表示组间差异不显著,n=12。下同。
2.2 黏附对细胞损伤的影响表2的结果说明,丁酸梭菌黏附于细胞后,LDH的释放和细胞损伤率均显著低于鳗弧菌组(P0.05)。
表2 丁酸梭菌和鳗弧菌对肠道上皮细胞的损伤率
组 别
胞外LDH细胞损伤率/%
试验组(丁酸梭菌组)
25.03±3.95b1.02±0.35b
对照组(鳗弧菌组)
57.33±5.25a5.81±1.02a
2.3 黏附对细胞存活率的影响结果见表3。
表3 丁酸梭菌和鳗弧菌黏附对
组 别
肠道上皮细胞存活率/%
1h
3h
6h
正常对照组
94.3±0.6a
94.7±1.5a
95.0±1.0a
试验组(丁酸梭菌组)
91.7±1.5a
90.7±0.58a
89.3±2.5a
对照组(鳗弧菌组)
85.7±4.0b
73.6±2.1b
60.0±3.6b
表3的结果说明,肠道上皮细胞在分别加入丁酸梭菌和鳗弧菌后,细胞的存活率表现不同。正常对照组的细胞数量基本没有变化;加入丁酸梭菌,在6h内,细胞存活率略微下降(P0.05);加入鳗弧菌后,1h内细胞存活率下降显著(P0.05),比正常对照组减少了18.6%,随着时间的延长,细胞的存活率越低。
2.4 丁酸梭菌抑制鳗弧菌黏附的作用表4结果表明,当丁酸梭菌、鳗弧菌共同孵育黏附上皮细胞时,丁酸梭菌能显著抑制鳗弧菌黏附细胞,黏附率降低了7.03%(P0.05)。
表4 丁酸梭菌抑制鳗弧菌的黏附
组 别
鳗弧菌的黏附率/%
试验组(鳗弧菌+丁酸梭菌组)
4.31±1.35a
对照组(鳗弧菌组)
11.34±3.21a
3 讨论
丁酸梭菌又名酪酸菌、宫入菌,是一种严格厌氧的芽孢菌。最早发现于日本,主要用于治疗人和动物肠道痢疾、腹泻等。丁酸梭菌能抑制产毒素大肠杆菌、艰难梭菌、幽门螺旋杆菌、弧菌等多种致病菌[9,10],还能显著地促进双歧杆菌等肠道有益菌的生长[11];而且,丁酸梭菌能形成芽孢,具有抗高温、抗胆酸盐等特性,作为饲料添加剂和兽药具有非常广阔的开发应用前景。细菌的体外黏附是选择益生菌的一个重要步骤。候选益生菌体外黏附能力是选择益生菌的一个标准。采用细胞模型的方法,测定能否抑制致病菌在细胞上黏附,更能体现益生菌在机体内的作用情况。Alain[12]报道了不同种乳酸杆菌、双歧杆菌对病原菌包括EHEC、ETEC、EPEC等黏附Caco22细胞株的影响,发现大多能够抑制病原菌黏附侵袭细胞,并且与活体研究得到相似的结果。本试验采用鱼的肠道上皮细胞模型,研究丁酸梭菌对上皮细胞的黏附作用,结果表明,该株丁酸梭菌可以黏附到鱼的肠道上皮细胞(见表1),与致病性鳗弧菌相比较,对细胞没有损伤,可以保持细胞的成活率(表2、3)。试验还进一步发现,此株丁酸梭菌具有很好的黏附抗菌能力,能够抑制水产致病菌鳗弧菌黏附于细胞,使其黏附率降低了7.03%(P0.05)。目前,关于黏附抗菌作用机理的了解还不深入,但其中很可能是由于益生菌本身的黏附能力,占据了致病菌的黏附位点,而抑制其在肠道内的定植。丁酸梭菌的抗菌作用,在一定程度上可能是由于其占位作用,阻止了鳗弧菌在细胞上的黏附定植。但是具体的机制还有待于进一步的试验来探讨。因此,该株丁酸梭菌可以黏附到鱼肠道上皮细胞,对上皮细胞没有损伤,并有效抑制致病性鳗弧菌对肠道上皮细胞的黏附,可以作为水产用益生菌做进一步的探讨。
转自《中国兽药杂志》
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