检测细胞增殖，你的方法用对了吗

发布时间:2018-8-26 21:29:49 点击数：次

检测细胞增殖的方法很多，MTT、CCK8、BrdU等等，你知道细胞可以CFSE染色用流式来检测细胞增殖么？好啦，不知道的同学搬好小板凳排排坐啦！

CFSE是一种荧光染料，脂溶性高，易进入细胞，可以与胞内氨基酸发生不可逆的结合，在细胞的分裂过程中能够进入子代细胞，同时荧光强度也变为母细胞的一半，可用流式或荧光显微镜对其进行分析。

下面我们就开始动手，用流式来检测脾淋巴细胞的增殖。

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—先准备一些试剂—

ConA储存液：用双蒸水配置终浓度为1mg/ml（×）

CFSE储存液：用DMSO配置终浓度为5mM的CFSE溶液（×）

RPMI完全培养基：RPMI培养基+10%血清+1%双抗

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—实验正式开始—

1.脾淋巴细胞的制备

无菌操作取出小鼠脾脏，研磨成单细胞悬液，用红细胞裂解液或者小鼠淋巴细胞分离液去除红细胞，将细胞过40μm细胞滤网后，进行细胞计数。样本清洗液洗涤（可用PBS或者不含血清双抗的培养基代替），rpm离心5min，用PBS重悬，调整细胞浓度为/ml。

2.CFSE标记脾细胞

取部分细胞作为不染色组阴性对照，其他细胞加入CFSE溶液，使得终浓度为5μm，室温避光孵育15min，加入5倍体积的完全培养基，室温静置5min，释放多余的未结合的CFSE来终止其染色。rpm离心5min，用与CFSE染色时相同体积的RPMI完全培养基重悬细胞沉淀，使其细胞浓度仍为/ml。

3.ConA与脾细胞孵育

取96孔圆底细胞培养板，CFSE染色组和不染色组分别设置ConA组和PBS组，将细胞进行铺板，先将CFSE染色和不染色的细胞2倍稀释，每孔μl细胞铺板。

将ConA储存液进行倍稀释，在ConA组中每孔加入μl配置好的ConA工作液，使得终浓度为5μg/ml（这时就是倍稀释啦），在PBS组中加入μl完全培养基（这样铺板密度就为5×/孔）。将细胞培养板置于37℃，5%CO2的培养箱中培养72小时。

4.流式上机检测

收集各组细胞，染色组细胞进行CD3表面染色，以对脾细胞中的淋巴细胞的增殖进行检测。流式FITC通道分析增殖的脾细胞所占的比例。

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—看看我做的结果吧—

用的BDC6流式细胞仪，直接截图啦。首先是不染色组，圈出P1门，直方图圈出细胞，基本都是CFSE阴性的。

接下来看染色组，因我们分析的是脾淋巴细胞，所以是在CD3inP1门里看CFSE阳性，发现几乎所有细胞都被CFSE染色。细胞增殖仅为1%。

在ConA刺激组的直方图中，我们可以明显看到与PBS组相比，左边多出3个小峰，这就是增殖的脾淋巴细胞啦，同样在散点图中也能看到与PBS组相比多出三个分群，这就说明细胞在72h里传了三代。

好啦，实验结束，是不是更方便简单明了呢？