构建目的基因到载体
一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增，得到目的片段，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并测序鉴定质粒载体
概念
能够进行自主复制的环状DNA双链结构，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。特征
质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。质粒在宿主细胞体内外都可复制。通过这些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。
质粒DNA在大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。大肠杆菌感受态细胞的制备1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
2）取0.4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h
3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min
4）4℃离心10min（r/min）
5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽
6）用冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴30min
7）4℃离心10min（r/min）
8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）
9）分装细胞，ul一份，4℃保存。
质粒DNA的转化1）取ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min。
2）离心管放到42℃保温90s。
3）冰浴2min。
4）每管加ulLB液体培养基，37℃培养1h（r/min）。
5）取适当体积（ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置30min。
6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落。
质粒提取步骤1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，10转离心1min，弃上清
2）加ul溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ为细胞悬浮液）混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬，室温静置1-2min。
3）加入ul溶液Ⅱ（细胞裂解液），轻柔的反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
4）加入ul溶液Ⅲ（中和液），立刻轻柔地反复颠倒混匀5-6次，此时会出现白色絮状沉淀。
5）10室温离心10min，收集上清。
6）将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。
7）10转离心1min，弃滤液。8）加入ul溶液PB（洗涤液）10转离心1min，弃滤液，目的是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。
9）加入ul溶液W（去盐液），10转离心1min，弃滤液，重复一次。
10）10转离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。
11）将DNA纯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加50-ul溶液Eluent（为无菌的双蒸水，PH为8.0-8.5）室温放置2min。
12）10转离心1min，此时管底即为高纯度的质粒DNA，质粒于-20℃保存。
质粒DNA和其他包装质粒共转染T细胞产生病毒（即病毒包装）
名词解释T细胞是由细胞派生,表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系,被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白或是用以包装病毒。脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体，可作为生物膜，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。共转染的操作步骤第一天：用无抗生素DMEM+10%FBS铺板FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度。第二天：1.ul无血清培养基稀释2ug表达质粒+1.5ugpsPAX2+1.5ugpMD2.G
2.ul无血清培养基稀释15ul脂质体0
3.5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min
4.从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。
5.6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+10%FB（从此刻开始算时间）。第三天：1.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上第四天：1.转染后48和72h分别收获含病毒的上清。
2.rpm离心20min，0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀。
3.10转离心浓缩细胞、分装-80C贮存。
4.滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。病毒包装的原理质粒DNA为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜，pMD2.G为慢病毒的膜蛋白质粒，通过lipofectamine0进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因RNA与psPAX2、pMD2.G基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出DNA，该基因再整合到靶细胞的基因组中，完成转染过程，因为质粒DNA只能转录出病毒RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。
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