??羊膜是羊膜囊的最内层，胎儿在羊膜囊中发育，羊膜是无血管的薄片，上皮层和基质层可以区分开来。人羊膜上皮细胞（hAECs）和人羊膜间充质基质细胞（hAMSCs）是分离的两种细胞群。不同的体外和体内研究显示，hAECs和hAMSCs对先天免疫细胞[巨噬细胞、树突状细胞（DC）]、中性粒细胞、自然杀伤细胞(NK)和适应性免疫(T和B细胞)的不同免疫细胞亚群具有广泛的免疫调节活性。支持hAECs和hAMSCs在再生医学中发挥有益作用的证据在过去十年中呈指数增长。的确，hAECs和hAMSCs及其条件培养基（CM）在以失调/慢性炎症反应和自身免疫性疾病等为特征的疾病中的再生促进作用已经观察到，如肺纤维化、肝纤维化、胶原诱导性关节炎（CIA）、结肠炎、大肠炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，多发性硬化动物模型）和创伤性脑损伤等。
再生过程中，免疫成分（细胞因子和趋化因子以及被募集到损伤部位的免疫细胞）在触发组织再生和损伤中起着关键作用。的确，在炎症阶段，受损和死亡的细胞连同细菌和其他病原体或碎片一起被去除，但是如果没有适当地调节和抑制，炎症可能发展成慢性炎症，导致受影响组织的持续变性，最终导致纤维化和组织功能丧失。在本章中，我们将讨论hAECs和hAMSCs的免疫调节特性以及它们如何作用于参与组织再生的不同免疫细胞。我们将区分由hAECs和hAMSCs产生的研究，讨论两者之间的差异。
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1对T细胞的影响（体外-体内）2对单核细胞和巨噬细胞的影响（体外-体内）3对树突状细胞（DC）的影响（体外）
4对B细胞的影响（体外-体内）5对自然杀伤细胞(NK)的影响（体外）6对中性粒细胞的影响（体外-体内）1
对T细胞的影响▲▲▲体外在体外，现已广泛认识到hAECs和hAMSCs在多种刺激诱导下均以剂量依赖的方式抑制T淋巴细胞的增殖。特别地，hAECs抑制混合淋巴细胞培养物中异基因外周血单个核细胞（PBMC）、有丝分裂原（如ConA）、植物血凝素（PHA）和细胞巨病毒（CMV）召回抗原诱导的T细胞增殖。相反，hAECs不能抑制IL-2预激活的T细胞的增殖，其中T细胞激活状态是诱导抑制的关键因素。hAMSCs在同种异体MLCs中通过ConA，PHA和T细胞受体交联（抗CD3/抗CD28）抑制T细胞增殖。淋巴细胞增殖的抑制是可逆的，正如先前暴露于hAMSCs的应答细胞能够在新的MLCs中针对原始或新的同种异体PBMC刺激细胞增殖。此外，hAMSCs除了抑制原始PBMCs外，还能够抑制有抗原经力的PBMCs（次级免疫应答）。
一些研究称hAECs和hAMSCs需要与PBMC接触，来发挥其免疫抑制作用。而其他研究已经证明，免疫抑制的发生与细胞接触无关。此外，由hAECs和hAMSCs培养产生的CM对淋巴细胞具有抗增殖作用，从而支持分泌的抑制因子的参与。hAECs和hAMSCs的抑制特性不因继代培养或hAMSCs的细胞永生化(通过诱导hTERT在hAMSCs中过分表达而获得)而改变。另外，冷冻保存已被证明能显著降低hAECs和hAMSCs免疫调节潜能。
hAECs和hAMSCs之间有一些明显的差异。例如，与INF-γ预孵育已显示出增强hAMSCs对刺激PBMC的抗增殖特性，而hAECs的抑制作用似乎不受INF-γ的影响。这些差异可能仅仅是由于不同的实验设置，或是施加在hAECs和hAMSCs上的不同的作用机制。hAMSCs及其CM可抑制活化的CD4和CD8T细胞增殖。另外，hAECs和hAMSCs的特异性T细胞亚群和相关细胞因子的调节已被发现。事实上，hAECs和hAMSCs能够降低Th1相关细胞因子IFN-γ的表达。此外，hAMSCs及其CM可降低Th9(IL-9)和Th17(IL-17A，IL-22)细胞因子的表达，增强IL-2和TGF-b的表达。根据羊膜细胞(hAECs或hAMSCs)或CM的类型、应答细胞(PBMC、T细胞或脾细胞)和使用的活化刺激物，得到了一些差异。例如，在存在hAECs、hAMSCs或其CM的MLCs中IL-10增加或减少的水平。有趣的是，调节性T细胞被发现在活化的PBMC与hAECs、hAMSCs、CM培养中增加。
体内在过去的几年中，由于hAECs和hAMSCs具有免疫调节活性，已被用作潜在的治疗动物模型中用来改变其免疫应答，如炎症性疾病，自身免疫性疾病等。
hAECs治疗主要应用于神经疾病和肺纤维化模型，得出不错的结果。hAECs治疗后病理体征的改善也归因于调节活性的作用，即移植细胞在不同水平的T细胞免疫应答（如T细胞募集、活化和分化）中发挥作用。具体而言，给予用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）诱导的EAE小鼠hAECs，可导致多发性硬化模型中枢神经系统内T细胞浸润减少、抑制MOG特异性T细胞增殖，IL-2、TNF-α和IFN-γ减少，IL-10水平升高，并有利于T细胞向Th2表型转移。hAECs还被给予处于缓解期的EAE小鼠（由暂时的皮质类固醇治疗诱导），以评估细胞治疗是否可以延长缓解时间，从而延缓EAE的复发。在这种情况下，hAECs治疗增加了MOG注射部位附近引流性腹股沟淋巴结的调节性T细胞(CD4+CD25+FoxP3+Treg)水平，而CD4和CD8T细胞亚群没有变化。作者提出，Treg水平的较高百分比可能有助于外周抑制MOG特异性T细胞反应和改善疾病状况。
在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中，hAECs的肺Treg水平也明显增加。作者在体外通过分泌TGF-β来诱导小鼠CD4原始细胞FoxP3转录的能力，并提出hAECs在体内可促进Treg的诱导。此外，Treg扩增/诱导是hAECs介导的巨噬细胞从M1向M2极化的关键，在肺修复中起着重要作用。
在CIA（自身免疫性类风湿性关节炎的实验模型）小鼠中用hAMSCs治疗后，也说明了其与T细胞亚群的相互作用。在这种疾病中，自身免疫应答涉及自身反应性Th17和Th1细胞的发展，它们可以进入关节，以及随后其他炎症细胞的募集。作者观察到，在用hAMSCs治疗的小鼠中，从引流淋巴结获得的T细胞显示出较低的增殖活性，并产生较低水平的Th1和Th17细胞因子，但IL-10水平较高。此外，hAMSCs处理的动物在引流淋巴结中的Treg数量显著增加。作者提出，外周Tregs的产生是hAMSCs抑制Th1/Th17型应答能力的原因，证实了它们能够减轻严重关节炎症状的能力。
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对单核细胞和巨噬细胞的影响▲▲▲体外hAMSCs和hAECs除了作用于T细胞外，还可以通过降低LPS刺激诱导的TNF-a和IL-6细胞因子的产生而直接作用于单核细胞。有趣的是，hAMSCs及其CM可诱导U单核细胞系和外周血单核细胞向巨噬细胞样细胞分化。此外，hAMSCs及其CM可阻断单核细胞向炎性M1巨噬细胞的分化和成熟，使单核细胞向具有抗炎性M2样表型和功能的巨噬细胞分化。确实，暴露于hAMSCs或其CM的单核细胞表达M2标记，如CD、CD20、CD23和CD，具有较高的吞噬活性，并产生较高的IL-10和低促炎细胞因子，包括IL-1a、IL-1b、IL-12、IL-8、TNF-a、MIP-1a、MIP-1b、MIG、RANTES和IP-10。这种与共刺激分子表达减少相关的细胞因子分布使这些细胞不能诱导T细胞增殖和Th1极化，但它们能够增加Treg亚群。重要的是，在存在hAMSCs或其CM的情况下向M2条件分化的单核细胞保持M2样特征，但随着抗炎谱的增强，共刺激分子CD80的表达减少，吞噬活性降低，炎症趋化因子的分泌减少。鼠的巨噬细胞也被证明是受羊膜细胞的影响。的确，来自hAECs培养的CM已经显示出抑制小鼠巨噬细胞的迁移和将巨噬细胞表型向M2转移。此外，发现hAMSCs及其CM对小鼠巨噬细胞的激活状态、细胞因子表达和表型均有调节作用。
有趣的是，羊膜细胞及其巨噬细胞也可以调节人类小胶质细胞（大脑和脊髓中的常驻巨噬细胞）的激活。事实上，与hAMSCs共培养的小胶质细胞增殖和TNF-α炎性细胞因子的产生被抑制。此外，hAMSCs或它们的CM可促进缺氧-葡萄糖所致缺血性脑损伤器官型皮质脑片中M2小胶质细胞的增殖。
体内巨噬细胞不仅在触发炎症过程中发挥核心作用，而且在其分辨率方面也起着关键作用。近来，巨噬细胞被证明是介导hAECs所发挥抗纤维化作用的基础。最初，Murphy和同事观察到hAECs给药减少了博莱霉素激发小鼠模型的肺中巨噬细胞的浸润。但是后来，使用巨噬细胞功能受损的小鼠（表面活性剂蛋白[Sftpc-/-]小鼠），结果证明hAECs治疗后观察到的有益效果严格地依赖于巨噬细胞募集和巨噬细胞向交替激活（M2）的极化表型。最近，研究者提供了进一步的证据，支持hAECs倾向于M1-M2转换，这有助于hAECs在肺中的修复作用。
调节巨噬细胞活性的能力也与减少hAECs注射液在CCL4治疗小鼠中产生的肝纤维化有关。此外，在脑损伤和脑出血模型中，hAECs与巨噬细胞的相互作用对于疾病改善是必不可少的，其中小胶质细胞被激活并随着促炎细胞因子的分泌和促进而发生功能改变，迁移、增殖和吞噬活性。局部移植hAECs的动物损伤后血肿周围组织中小胶质细胞浸润减少，小胶质细胞活化水平降低，OX-42染色降低，形态学改变。有趣的是，羊膜上皮细胞(ST细胞)亚群的分泌体在EAE诱发的小鼠视神经炎模型中被证明具有抗炎潜能，从而在鼻内用ST处理的小鼠视神经中激活巨噬细胞/小胶质细胞，使得分泌小体减少。
如hAECs所证明的，hAMSCs还通过将炎症M1的分化转变为抗炎M2巨噬细胞而发挥抗炎作用。这是最近在大脑和脊髓损伤模型中显示出来的。巨噬细胞/小胶质细胞是参与脑/脊髓损伤后炎症反应的关键细胞因子，其通过释放促炎细胞因子和其他毒性因子而导致神经功能缺损。hAMSCs移植可显著减少活化巨噬细胞/小胶质细胞和神经凋亡细胞的数量，hAMSCs及相关CM均可增加Ym1(M2典型标志物)的基因和蛋白表达，而M1前炎症因子TNF-α的表达无变化。
有趣的是，从hAMSCs中获得的CM被创新地用于再培养巨噬细胞活性，以提高它们在体外和体内创伤愈合模型中的组织再生/修复能力。糖尿病小鼠背部创面连续性全切切口创面愈合模型的建立与未培养的巨噬细胞相比，注射来源于在来自hAMSC的CM存在下进行的单核细胞体外分化的巨噬细胞可加速溃疡的闭合。此外，在皮肤创面周围注射来自hAMSCs的CM可降低炎症标志物如TNF-α和iNOS的表达，但增加小鼠M2标志物(Fizz1)的表达，提示CM可诱导体内M2样巨噬细胞的生成。
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对树突状细胞的影响▲▲▲体外hAECs和hAMSCs的免疫抑制特性已在DCs显示。发现hAECs和hAMSCs在直接接触和非接触条件下（跨孔设置）与单核细胞共培养时，均可防止单核细胞向DC分化和成熟，从而表明分泌的抑制因子参与了分化和成熟。此外，hAECs或hAMSCs培养物产生的CM也被证明可以防止DC发展，这表明羊膜细胞可以分泌抑制因子，而不需要来自单核细胞的接触或旁分泌信号。然而，与直接接触单核细胞相比，hAECs分泌因子对DC的分化作用似乎更弱。此外，hAECs的抑制作用不如hAMSCs强，暴露于hAECs或hAMSCs的细胞的表型也不同。在hAMSCs存在下分化为DC的单核细胞在没有DC标记CD1a的情况下继续表达单核细胞标记CD14。此外，还观察到DC激活/成熟标记CD和CD83以及抗原呈递和共刺激相关的标记物(CD80、CD86、CD40、PDL-1、PDL-2和HLA-DR)的表达强度显著降低。此外，单核细胞在存在表达CD32、CD和CD23的hAMSCs的情况下分化为DC，表明单核细胞不仅能向树突状谱系分化，而且向M2样巨噬细胞表型转变。相反，在hAECs存在下，向DC分化的单核细胞显示出CD1a的显著减少，同时CD14的百分比略有增加。这些细胞表达CD32、CD23水平低，而CD和巨噬细胞标志物PM-K2水平低。此外，hAECs的存在没有改变共刺激分子CD80、CD83和CD86的表达，这与对照DC相似。与hAMSCs不同，hAECs的存在增加了PDL-1的表达。据报道，hAECs与炎性INF-γ预孵育可增强其对单核细胞来源DC成熟的抑制作用，特别值得注意的是，免疫抑制分子HLA-G在与预激活的hAECs共培养的单核细胞上的表面表达显著增加。
此外，与完全成熟的对照组DC相比，在hAECs和hAMSCs存在下分化的单核细胞产生较低水平的炎性细胞因子IL-12p70、TNF-a、CXCL9和MIP-1a以及较高水平的IL-10。此外，hAECs可诱导PGE2、IL-6、MIC-1和HLA-G的分泌（INF-γ预激活时），而hAMSCs可增加-IL1-β和MCP-1/CCL-2的分泌。由于表型和细胞因子分泌谱的变化，在hAECs和hAMSCs存在下获得的细胞对同种异体T细胞的刺激能力受损。在hAMSCs存在下分化的单核细胞显示出刺激CD4+和CD8+T细胞增殖的最小能力，而在hAECs存在下获得的单核细胞显示出仅降低刺激CD8β细胞增殖的能力。虽然hAECs和hAMSCs对DC的体外特性已经被证实，但据我们所知，目前还没有研究报道羊膜细胞在体内对DC的作用。
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对B细胞的影响▲▲▲体外迄今为止，鲜有羊水细胞体外作用于B细胞的报道。来自hAECs培养的CM已显示抑制从脾脏和肠系膜淋巴结分离的LPS激活的小鼠B细胞的增殖。此外，来自hAECs培养的CM显著增加B细胞凋亡。
体内目前，还缺乏证据说明羊水细胞与B细胞在体内的免疫调节作用。以活化的B细胞产生免疫原特异性自身抗体为特征的两种自身免疫疾病模型，即MOG诱导的EAE和CIA，作者报道了hAECs和hAMSCs降低血清免疫原特异性IgG水平的能力。而hAECs治疗组CD19、B细胞数量无明显变化。
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对自然杀伤细胞的影响▲▲▲体外hAECs和hAMSCs均显示出影响NK细胞的扩增和活性。确实，在特定的存在下细胞因子，仅用细胞因子来实现的情况下，hAMSCs能有效地扩增脐血NK祖细胞。此外，hAECs和hAMSCs均以剂量依赖的方式抑制NK细胞对K细胞的杀伤作用。有趣的是，羊膜细胞永生化并没有改变它们的抑制特性。值得注意的是，与hAECs相比，hAMSCs（原代和永生化）对NK细胞毒性具有更高的抑制活性。NK细胞活化取决于细胞表面受体介导的激活信号和抑制信号之间的平衡。有趣的是，与羊膜细胞共培养后，观察到NK激活受体NKP30、NKP44、NKP46和CD69的下调。NK细胞毒性与NK细胞共培养后羊膜细胞中IL-10和PGE2的表达有关。事实上，这些因素的阻断抗体的加入显著增加了NK细胞毒性。hAECs和hAMSCs与细胞毒活性一起抑制NK细胞的活化，显著抑制活化的NK细胞产生IFN-γ。
虽然hAECs和hAMSCs对NK细胞的体外特性已经很明确，但据我们所知，没有关于其在体内作用的报道。
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对中性粒细胞的影响▲▲▲体外中性粒细胞也被报道为羊膜细胞的靶标。来自hAECs的CM已被证明抑制小鼠中性粒细胞在体外的迁移。值得注意的是，来自hAECs的CM不诱导中性粒细胞的凋亡。
体内有证据表明羊膜细胞可影响中性粒细胞在体内的迁移和活化。在暴露于博莱霉素的小鼠中进行hAECs治疗可减少肺中性粒细胞的募集，而在CIA小鼠中给予hAMSCs可减少关节中性粒细胞的浸润和髓过氧化物酶活性。
研究表明hAECs和hAMSCs以及它们培养产生的CM如何作用于不同的免疫细胞。hAECs和hAMSCs在免疫调节方面存在在差异。两种细胞群之间可能没有大的差异，因为两种细胞都能影响几乎所有免疫细胞的功能，然而，hAECs与hAMSCs在应答强度、INF-γ预处理对hAECs的影响、接触或非接触细胞培养条件对hAECs的影响等方面存在差异。
另一方面，这些差异可能强调hAECs和hAMSCs可以作用于相同的免疫细胞，但具有不同的作用机制。从临床角度来看，它们都具有强大的免疫调节活性，并且可能通过不同的作用机制，这一事实表明，它们可以潜在地发挥协同作用，同时使用并增强其个体效力。虽然单种羊膜细胞类型的免疫调节能力从未与混合的细胞所发挥的免疫调节能力相比较，但是使用从全羊膜消化中获得的hAECs和hAMSCs的混合物的研究证实了与那些使用分离的细胞群(在体外和体内)获得的免疫调节相同。
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