▲▲▲欢迎 糖尿病肾病(DN)是临床最常见的糖尿病微血管并发症,是以肾小球硬化为特征的一种继发性肾脏疾病[1]。其发病过程与肾脏炎症反应的发生、发展密切相关[2]。随着全世界范围内糖尿病发病率不断升高,DN的发生率也逐年攀升。研究表明,糖尿病并发肾脏功能损害是糖尿病患者致死、致残的重要原因[3],患者因此承担了昂贵的医疗费用,给病人及社会带来巨大的经济负担[4]。积极寻找具有预防和治疗DN的有效药物是药物研究者 两色金鸡菊(CoreopsistinctoriaNutt.)为一年生菊科金鸡菊属植物。干燥全草名为蛇目菊,又名昆仑雪菊、血菊、金鸡菊等,以头状花序入药,原产于北美地区[5]。始载于《新华本草纲要》,味甘、性平,归肝、大肠二经。现代药理学研究表明,两色金鸡菊有抗氧化、降血压、降血脂、降血糖等作用[6]。鉴于上述药理作用均与DN发生、发展密切相关,本研究通过高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞建立体外DN模型,从DN炎症发病角度考察两色金鸡菊提取物对DN细胞模型中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、NF-κB信号通路中p-65表达的影响。
1材料与方法
1.1材料1.1.1细胞株及培养条件大鼠肾小球系膜细胞系(HBZY-1武汉博士德生物有限公司)。根据细胞培养说明书要求,将大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)传代于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液(Hyclone)的培养皿中。将传代后含有细胞的培养皿置于含5%CO2、37℃培养箱中进行培养。1.1.2两色金鸡菊乙酸乙酯(AC)溶液的配制精密称取AC冻干粉0.1g,置于1.5mL的EP管中,加入二甲基亚砜(DMSO)溶液至总体积为1mL,反复震荡使粉末充分溶解于DMSO中,得到浓度为mg/mL的AC溶液。用直径为0.2μm的微孔滤膜对溶液进行过滤,收集滤液。在AC溶液中加入一定比例的DMSO,分别稀释不同浓度浓度的AC储备液,用于细胞干预实验。1.1.3主要仪器及试剂SZX7-光学显微镜(Olympus日本),R高速冷冻离心机(Ep-pendorf德国),Steri-CultCO2培养箱(Thermo美国),ChemiDocMP凝胶成像仪(Bio-Rad,美国),-垂直电泳槽(Bio-Rad美国),Trizol(In-vitrogen美国),兔源MCP-1抗体(Abcam美国),兔源p-65抗体(Abcam美国)等。
1.2方法1.2.1细胞分组及干预方法将培养皿中覆盖率达80%~90%的HBZY-1细胞离心收集,用无血清培养液混悬细胞,用血球计数板对培养液中细胞进行计数。将浓度为1×/mL细胞混悬液,按每孔2mL接种于6孔板中培养4~6h,待细胞贴壁生长后,PBS清洗细胞2次,将配置好的含高糖50mM及提取物不同浓度的培养液加入细胞中,分为正常组(NC)、高糖组(HG)、高糖组+AC25μg/mL、高糖+AC50μg/mL组、高糖+ACμg/mL组、高糖+ACμg/mL组,各组每个浓度设3个复孔,干预24h后,弃上清,用于各项指标的检测。1.2.2实时荧光定量PCR实验方法采用Trizol法提取各组细胞总RNA。取各组总RNA2μg,采用Thermo反转录试剂盒,按照说明书要求反应体系进行溶液配制。分别取待测样品cDNA及标准品DNA为模板,扩增条件为95℃3min,95℃10s,60℃30s共40个循环。采用QuantiFastSYBRGreenPCRKit试剂盒进行实时荧光定量核酸扩增,每个样本重复3个复孔。采用Bio-RadCFX96荧光定量PCR仪进行数据采集和分析。在目的基因和内参基因有相近的扩增效率前提下,以2-△△Ct值表示各样品中待测因子mRNA的相对表达量,各引物序列见表1。 用待测因子的上下游引物采用ThermoPCR扩增试剂盒进行PCR扩增后,将其与溴芬兰混合后加入1%琼脂糖凝胶进行电泳,紫外灯下可见不同目的基因PCR产物条带清晰。凝胶成像仪对其目的基因条带灰度值进行分析。
1.2.3Westernblot实验方法应用细胞裂解液提取干预后的各组细胞的总蛋白,在10%的聚丙稀酰胺凝胶中电泳,将蛋白电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,应用10%脱脂奶粉封闭后分别加入抗内参抗体、抗目的蛋白抗体MCP-1、p-65、GAPDH、β-actin稀释分别为1∶0、1∶0、1∶、1∶,再与相应的二抗反应,用显影剂显影目的条带。凝胶成像仪对其目的基因条带灰度值进行分析。
1.3统计学处理采用SPSS16.0统计软件对数据进行处理。实验过程中涉及的所有数值以均值±标准差(x-±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析(One-Way-Analysis),两组间比较采用独立样本t检验(Student’sttest),以P0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1两色金鸡菊乙酸乙酯提取物对高糖诱导下HBZY-1细胞MCP-1表达的影响
HG组MCP-1mRNA与蛋白表达高于NC组(P0.01)。AC不同剂量干预HBZY-1细胞24h后,各组MCP-1mRNA与蛋白表达量明显下调(P0.05)。其中HG+AC25μg/mL组、HG+AC50μg/mL组与HG组比较mRNA与蛋白表达差异均无统计学差异。HG+ACμg/mL能显著下调MCP-1mRNA与蛋白的表达,与HG组比较,差异有统计学意义(P0.05)。HG+ACμg/mL组能强烈抑制MCP-1mRNA与蛋白的表达(P0.05)(图1、图2)。
2.2两色金鸡菊乙酸乙酯提取物及标志性成分马里苷对高糖诱导下HBZY-1细胞ICAM-1表达的影响
HG组ICAM-1mRNA表达高于NC组(P0.01)。AC不同剂量干预HBZY-1细胞24h后,各组ICAM-1mRNA表达量明显下调。其中HG+AC25μg/mL组、HG+AC50μg/mL组与HG组比较差异有统计学意义(P0.01)。与HG组比较,HG+ACμg/mL能显著下调ICAM-1mRNA的表达,差异有统计学意义(P0.05)。HG+ACμg/mL组能强烈抑制HBZY-1细胞中ICAM-1mRNA表达(P0.05)。AC对高糖诱导HBZY-1细胞中炎性因子ICAM-1mRNA表达有显著抑制作用,见图3。
2.3两色金鸡菊乙酸乙酯提取物对高糖诱导下HBZY-1细胞中NF-κB信号通路中p-65表达的影响
高糖诱导下的HBZY-1细胞中,p-65蛋白表达明显升高,与NC组比较,差异有统计学意义(P0.05)。不同剂量AC分别干预24h后,对各组蛋白表达量进行半定量分析。经统计分析可知,HG+AC25μg/mL组与高糖组比较,p-65表达差异无统计学意义,HG+AC50μg/mL组、HG+ACμg/mL组、HG+ACμg/mL组细胞中p-65表达均显著低于HG组(P0.01)。两色金鸡菊乙酸乙酯提取物能明显下调高糖诱导下HBZY-1细胞中异常高表达的转录因子p-65,见图4。
3讨论
大部分研究者认为,DM发病过程中糖、脂、蛋白质代谢紊乱是导致DN发生和发展的诱发因素。然而以上诱发因素仅能部分解释肾脏损伤的原因。确切的证据显示,DN的发病是由遗传、性别、年龄、环境因素等多种因素共同作用下形成的一种复杂的、网络式的病理生理过程[7]。研究指出,机体免疫系统的激活及慢性炎症反应与DN发生和发展密切相关。参与DN发病过程中的细胞因子、生长因子、趋化因子、黏附分子、转录因子与多种免疫细胞如单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞是DN发病过程中的重要参与者[8]。炎症反应通过激活多种信号通路,促进细胞外基质成分(ECM)如CollagenⅣ、FN等的聚集,导致肾小球、肾小管基底膜增厚,最终引起小球硬化及间质纤维化[9]。可见炎症反应与DN肾脏纤维化进程密切相关。 MCP-1是一种分泌型蛋白,通过与细胞表面的相应受体结合主要激活单核细胞与组织中的巨噬细胞而发挥生物学效应[10]。肾脏中多种促炎因子的激活是产生MCP-1的直接原因。MCP-1的表达可以视为肾组织炎症病变的标志物。在糖尿病诱导下的肾组织细胞中,MCP-1的mRNA水平与蛋白水平出现异常高表达,这一现象说明DM的发生,促进MCP-1表达进而促进肾脏巨噬细胞的聚集,而导致肾脏炎症反应的发生[11]。 ICAM-1是位于细胞表面的一种糖蛋白,主要表达于肾组织内皮细胞及白细胞中。虽然ICAM-1参与DN的发病机理尚未完全阐明,研究者已发现,DM与肾脏疾病患者血清中ICAM-1水平显著高于正常人水平,同时血清ICAM-1水平与尿液中微量白蛋白的水平存在相关性[12]。临床研究发现,糖尿病患者血清中ICAM-1水平的升高是导致肾小球率过率显著降低进而诱发持续尿蛋白产生的独立危险因素[13]。ICAM-1通过促进肾小球巨噬细胞浸润,促进炎性反应的发生,进而激活成纤维母细胞增生、内皮细胞损伤,肾间质纤维化而诱发肾损伤,肾脏中损伤的内皮细胞进一步促进炎症反应,加剧肾脏病变。 本研究结合以上国内外关于DN研究进展,选择与DN炎症反应密切相关的因子MCP-1、ICAM-1为作用靶点,建立体内外DN模型,从DN炎症发病的角度探讨了两色金鸡菊乙酸乙酯提取物防治DN可能的作用机制。由实验结果可知,两色金鸡菊乙酸乙酯提取物能显著降低细胞中MCP-1、ICAM-1蛋白及mRNA表达水平,提示其可能具有抑制DN炎症反应作用。DN发病过程中,多种信号通路异常反应及相互作用导致DN肾脏病理及功能异常[14-16]。NF-κB信号通路是慢性炎性疾病及自身免疫学疾病的重要参与者[17]。核转录因子NF-κB,通常由p-65、p-50、Iκ-α等亚基所组成同源或异源二聚体,主要位于细胞浆中。当细胞受到外界刺激后,NF-κB发生核转位,进入细胞核,调控下游靶基因的转录,其中多种细胞因子如MCP-1、ICAM-1、TNF-α、iNOS、IL-β1表达均受转录因子NF-κB的调控。两色金鸡菊乙酸乙酯提取物能显著抑制大鼠肾小球系膜细胞NF-κB中p-65蛋白表达,说明NF-κB可能为两色金鸡菊乙酸乙酯提取物抑制大鼠肾小球系膜细胞炎症反应的作用靶点之一,但确切作用有待于进一步研究。
参考文献：略
赞赏
