▲ 采用SPSS16.0统计学软件（美国IBM公司）进行统计分析。本研究中测量指标的数据资料经Shapiro-Wilk检验呈正态分布，以x_±s表示，组间方差经Levene检验方差齐。采用均衡分组、单因素干预多水平实验设计，空白对照组、LPS对照组、BMSCs组和CB-BMSCs组间BMSCs上清液中TNF-α和IL-1β质量浓度以及各组RMG增生率、MFI和迁移细胞数的总体差异比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法。采用双尾检测法，P0.05为差异有统计学意义。
2结果2.1BMSCs的形态学特征
培养的第3代细胞贴壁生长，呈纺锤状，用间质干细胞成骨、成脂分化诱导后可分化为成骨细胞和脂肪细胞形态，CD90、CD34和CD44表达的阳性细胞率分别为（95.21±2.13）%、（1.84±0.92）%和（96.75±3.30）%，证实为BMSCs。
2.2RMG的形态学特征及鉴定大鼠视网膜分离和培养后1d可见细胞贴壁生长，细胞体为圆形或椭圆形，突起较少。原代培养后3d，约半数细胞的胞体变长，突起增多，呈不对称分支状。继续培养后10d，分支状细胞占多数，细胞体变大，突起变长（图1A）。培养的第3代细胞CD11b、Iba1表达阳性，在荧光显微镜下呈绿色荧光（图1B、C），但不表达GS，因此未见红色荧光（图1D）。阴性对照片均未见绿色或红色荧光。结合细胞的组织来源、细胞的形态特征及免疫荧光染色结果，证实为RMG。
图1SD大鼠RMG的培养及鉴定（标尺=μm）A：RMG纯化分离后继续培养10d可见分支状的细胞占多数B：培养的RMG中CD11b细胞表达阳性，呈绿色荧光（FITC），细胞核呈蓝色荧光（DAPI）C：培养的RMG中Iba1细胞表达阳性，呈绿色荧光（FITC），细胞核呈蓝色荧光（DAPI）D：培养的RMG中未见GS表达（Cy3），仅可见细胞核的蓝色荧光（DAPI）
2.3LPS活化后RMG的形态学改变LPS刺激后24h，RMG的形态由分支状转变为阿米巴样，细胞大小不一，细胞体呈椭圆形或短棒状，突起变短，突起数量减少（图2）。
图2LPS刺激前后RMG的形态学观察（标尺=μm）A：LPS刺激前RMG细胞多呈分支状B：LPS刺激后24h细胞呈阿米巴样
2.4各组BMSCs上清液中TNF-α、IL-1β的质量浓度ELISA法检测发现，空白对照组、LPS对照组、BMSCs组和CB-BMSCs组细胞上清液中TNF-α的质量浓度分别为（2.55±0.97）、（24.91±3.07）、（20.38±2.97）和（24.90±1.88）ng/ml，总体比较差异有统计学意义（F=.90，P0.05）；空白对照组、LPS对照组、BMSCs组和CB-BMSCs组细胞上清液中IL-1β的质量浓度分别为（1.12±0.36）、（10.40±2.76）、（7.00±1.75）和（9.55±1.11）ng/ml，总体比较差异有统计学意义（F=34.96，P0.05）。LPS对照组、BMSCs组和CB-BMSCs组细胞上清液中TNF-α和IL-1β的质量浓度均明显高于空白对照组，差异均有统计学意义（均P0.05），BMSCs组TNF-α和IL-1β的质量浓度均明显低于LPS对照组，差异均有统计学意义（均P0.05），而CB-BMSCs组与LPS对照组间细胞上清液中TNF-α和IL-1β质量浓度的比较差异均无统计学意义（均P0.05）（图3）。
图3各组共培养体系上清液中TNF-α和IL-1β的质量浓度TNF-α：F=.90，P0.05；IL-1β：F=34.96，P0.05.与空白对照组比较,aP0.05,与BMSCs比较,bP0.05（单因素方差分析，SNK-q检验，n=6）TNF：肿瘤坏死因子；IL：白细胞介素；BMSCs：骨髓间充质干细胞；CB-MSC：CX3CL1封闭的BMSCs
2.5各组共培养体系中RMG增生率的比较EdU细胞增生检测显示，LPS对照组、BMSCs组、CB-BMSCs组和空白对照组RMG增生率的总体比较，差异有统计学意义（F=42.94，P0.05）。空白对照组、BMSCs组、CB-BMSCs组RMG的增生率明显高于空白对照组，差异均有统计学意义（均P0.05）；BMSCs组RMG增生率明显低于LPS对照组，差异有统计学意义（P0.05）；而CB-BMSCs组与BMSCs组间RMG增生率的差异无统计学意义（P0.05）（图4，表1）。
图4各组共培养体系中RMG的增生情况（标尺=μm）增生的RMG呈红色荧光（EdU），细胞核呈蓝色荧光（Hoechst）。空白对照组仅见少量增生RMG，LPS对照组增生的RMG数明显增多，BMSCs组增生细胞少于LPS对照组，而CB-BMSCs组增生细胞与BMSCs组无明显差别BMSCs：骨髓间充质干细胞；CB-BMSCs：CX3CL1封闭的BMSCs
注：与空白对照组比较，aP0.05，与LPS对照组比较，bP0.05；与BMSCs组比较，cP0.05（单因素方差分析，SNK-q检验）RMG：视网膜小胶质细胞；MFI：平均荧光强度；BMSCs：骨髓间充质干细胞；CB-BMSCs：CX3CL1封闭的BMSCs
2.6各组共培养体系中RMG吞噬能力的比较采用流式细胞术检测RMG吞噬荧光微球后的MFI。LPS对照组、BMSCs组、CB-BMSCs组和空白对照组MFI值的总体比较，差异有统计学意义（F=70.55，P0.05），LPS对照组、BMSCs组、CB-BMSCs组RMG的MFI值均高于空白对照组，差异均有统计学意义（均P0.05）；BMSCs组RMG的MFI值明显高于LPS对照组，差异有统计学意义（P0.05）；CB-BMSCs组与LPS对照组间RMG的MFI值比较差异无统计学意义（P0.05）（图5，表1）。
图5各组RMG吞噬荧光微球后的流式细胞图LPS对照组、BMSCs组、CB-BMSCs组RMG吞噬荧光微球后的MFI均高于空白对照组，而BMSCs组RMG的MFI高于CB-BMSCs组和LPS对照组A：空白对照组B：LPS对照组C：BMSCs组D：CB-BMSCs组E：阴性对照片
2.7BMSCs对RMG迁移能力的影响LPS对照组、BMSCs组、CB-BMSCs组和空白对照组迁移细胞数量的总体比较，差异有统计学意义（F=15.49，P0.05）。LPS对照组、BMSCs组、CB-BMSCs组的迁移细胞数量明显多于空白对照组，差异有统计学意义（均P0.05）。BMSCs组迁移细胞数量多于LPS对照组，差异有统计学意义（P0.05）；而CB-BMSCs组与LPS对照组迁移细胞数量比较差异无统计学意义（P0.05）（图6，表1）。
图6各组RMG迁移能力的检测（标尺=μm）发生迁移的RMG为紫色小点，LPS对照组、BMSCs组和CB-BMSCs组细胞迁移数量多于空白对照组,而BMSCs组细胞迁移数量高于LPS对照组和CB-BMSCs组BMSCs：骨髓间充质干细胞；CB-BMSCs：CX3CL1封闭的BMSCs
3讨论视网膜变性疾病是难治的致盲眼病，目前对其发病机制尚缺乏透彻的了解。研究认为，RMG的活化及其诱发的炎症反应在视网膜变性疾病的发病过程中起到重要作用[3]。在视网膜变性疾病发病的早期，各种应激反应均可引起RMG的活化。RMG活化能分泌保护性因子，延缓感光细胞和视网膜神经节细胞的凋亡[8]。然而，RMG的过度或持续活化可产生蛋白酶、活性氧、促炎性因子等细胞毒性分子，诱发视网膜炎症反应，导致严重的病理性改变，最终形成不可逆性损伤[9]。本研究中发现，LPS刺激RMG后24h，RMG形态发生改变，其分泌的TNF-α和IL-1β增加，且细胞的增生、吞噬和迁移能力增强，这与Jiang等[10]的研究结果一致，证明LPS能够活化RMG，有利于在体外模拟变性的视网膜上RMG的状态。现已证实，BMSCs在中枢神经系统中能够调节小胶质细胞的活化状态，发挥神经保护和免疫调控作用[11]，而BMSCs能否与RMG相互作用，激活相关信号通路，维持视网膜稳态，相关报道较少。
BMSCs对视网膜炎症反应的调控是近年来研究的热点之一。在炎症微环境中，BMSCs能够对炎症信号产生反应，释放CX3CL1等扩散性可溶性因子，发挥抗炎作用[4,12]。CX3CL1在体外通过抑制TNF-α等促炎性因子的分泌，下调诱导型氮氧化物合酶在LPS活化的小胶质细胞中的表达，扮演着抗炎分子的作用[13]。本研究中也发现，与BMSCs共培养后，活化的RMG上清液中TNF-α和IL-1β的分泌量减少，而封闭BMSCs上的CX3CL1能够逆转BMSCs的这种抗炎作用，提示CX3CL1/CX3CR1信号通路可能参与了BMSCs对RMG相关炎症反应的调控。
本研究中发现，RMG与BMSCs共培养后，EdU标志（即处于细胞周期S期）的RMG细胞百分数较对照组降低，说明BMSCs能够降低RMG的增生率，这一现象可能与共培养后RMG自身分泌的TNF-α、IL-1β等促炎性因子的减少有关。BMSCs能够选择性抑制淋巴细胞的增生活性，阻止单核细胞向树突状细胞分化，并遏制树突状细胞的成熟及其抗原递呈作用，而这些效应均需要炎性介质的参与[14]。IL-1β等促炎性因子可作为分裂素，刺激小胶质细胞的增生[15]。Jose等[16]研究认为，BMSCs的这种抗增生作用是TNF-α依赖性的，BMSCs能够通过减少活化的小胶质细胞分泌TNF-α，使其细胞周期恢复到活化前的水平，从而实现对其增生活性的抑制。本研究中发现，CB-BMSCs同样能抑制RMG增生，与BMSCs比较差异无统计学意义，表明RMG增生可能受多种因素影响。
在RMG的吞噬能力方面，小胶质细胞具有吞噬β淀粉样蛋白的能力，减少其在脑部的沉积，减轻阿尔茨海默病的症状[17]；RMG还能吞噬侵入视网膜的真菌等微生物[18]。衰老、细胞应激等能够促使表达CX3CR1的RMG吞噬变性或死亡的视网膜细胞，清除细胞碎片，而在相同条件下，CX3CR1基因缺陷致使RMG吞噬能力减弱，引起大量细胞碎片的堆积，加重炎症反应，进一步诱导感光细胞凋亡，引发AMD[19]。本研究结果显示，BMSCs能够增强活化的RMG的吞噬能力；相反，封闭BMSCs上的CX3CL1后，其吞噬能力与LPS对照组无显著差异，提示BMSCs表面的CX3CL1与RMG上的CX3CR1发生交联后可能有助于RMG清除视网膜上的细胞碎片，延缓视网膜变性的进展。
本研究中对RMG迁移能力的实验表明，RMG与BMSCs共培养能够促进活化的RMG发生迁移，而CX3CL1封闭后会抑制BMSCs的这种促迁移作用。活化的小胶质细胞能够迁移到损伤区域，这一过程由可溶性因子调控[20]，通过形成浓度梯度改变受损或病变的组织细胞外基质，引导小胶质细胞迁移。在视网膜光损伤体外模型中加入外源性CX3CL1能促进RMG的迁移，减少感光细胞凋亡[21]。Combadiere等[22]研究发现，人类CX3CR1M基因多态性与RMG的迁移能力异常有关，增加了罹患AMD的风险。CX3CR1基因敲除小鼠视网膜上RMG的迁移能力减弱，使RMG积聚于视网膜下腔，释放血管内皮生长因子，诱发与人AMD相似的形态学和病理学改变[23]。
综上所述，BMSCs能够在体外抑制LPS活化的RMG的增生能力，可能通过激活CX3CL1/CX3CR1信号通路增强RMG的吞噬和迁移能力，使RMG从致病性表型向保护性表型转变，减轻视网膜的炎症反应，从而维持视网膜微环境的相对稳定状态。然而，CX3CL1/CX3CR1的下游通路如何传导以及是否有其他的信号通路参与BMSCs对RMG生物学功能的调控等问题尚未阐明，有待进一步研究。尽管如此，本研究在一定程度上解释了BMSCs眼内移植治疗视网膜变性疾病的作用机制，并为进一步开展相关的临床研究奠定了理论基础。
参考文献
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