第二章动物细胞悬浮培养技术
1概述
1.1动物细胞悬浮培养技术的概念
动物细胞悬浮培养技术是指在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器中大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术，也称动物细胞大规模培养技术（large-scaleculturetechnology）。
随着生命科学的发展，生物技术产业已成为当前市场中前景最为人看好的高技术产业。全球生物技术产业的销售额每五年翻一番，已成为增长最快的产业。当前全球销售额最高的6大类生物技术药物中，有5类是经哺乳动物细胞表达生产的，其产品销售额已占生物制药产品销售额的70％以上。动物细胞培养技术开始于上世纪初，到年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法。动物细胞大规模培养技术是以生物反应器培养细胞为基础，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，实现动物细胞工业化和规模化生产，欧美国家已经广泛将其应用于生物制药行业中，成为主流生物制药生产工艺技术的重要组成部份。
实际应用动物细胞大规模培养技术过程，需主要考虑高表达的细胞系或者高产病毒株的筛选、个性化细胞培养基的应用、生物反应器生产线体系的建立、反应器细胞培养工艺技术研究及验证等内容。其中，获得高表达的细胞系或者高产病毒株是成功应用动物细胞大规模培养的基质基础，个性化的细胞培养基为动物细胞大规模培养提供可靠的营养物质支持，以生物反应器为主体的生产线体系的建立是应用动物细胞大规模培养技术的硬件基础，而反应器细胞培养工艺技术研究则是重点，就像电脑硬件上的软件应用和升级开发才能更好发挥硬件功能一样，能有效地提升生物制品的生产效率、生产规模和产品质量。
1.2动物细胞悬浮培养技术的分类
动物细胞悬浮培养技术依据细胞是否具有贴壁依赖性，分为动物细胞全悬浮细胞培养和动物细胞微载体悬浮培养。全悬浮细胞（如CHO悬浮细胞株、BHK21悬浮细胞株等）可以在生物反应器中直接进行生产增殖，细胞自由生长、培养环境均一、取样简单、培养操作简单可控、放大方便、污染率和成本低。贴壁细胞（ST、Vero细胞等）在生物反应器中悬浮培养时需要借助介质表面，通常是微载体，其细胞所能达到的浓度和生产产品的产量依赖于微载体提供的生长表面积。微载体为动物细胞生长提供了便利的表面，具有极大的培养表面积/体积比。细胞能够实现高密度培养，使得微载体成为目前贴壁动物细胞大规模培养使用的主要介质。
与转瓶培养工艺相比，悬浮培养技术（包括全悬浮和微载体悬浮）的最大优势在于：第一、单位体积内有效工作细胞数量增加；第二、全密闭、管道化系统生产流程及过程自动化监控、控制技术，不仅减少了污染细胞的机会，而且在减轻劳动力强度的同时减少人为操作因素影响；第三、生物反应器容积的扩大，提升了终端产品的均一性，结合后期纯化工艺，不但产品产量明显提高，产品的质量也获得提高；第四、生产疫苗所用劳动力和车间、水、电、原材料、能源等成本远低于传统转瓶培养工艺，综合成本大大降低。
1.2.1全悬浮培养动物细胞技术
早在年Capstick,P.B.等实现BHK21细胞悬浮化培养后，Telling,R.C.等在年就开发了在不锈钢发酵罐中进行悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗，当前国外普遍采用－L、最大已达L的搅拌式生物反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫苗。国内金宇保灵生物制品有限公司在国内首家采用悬浮培养技术进行口蹄疫疫苗的生产，在开发过程中，针对悬浮培养工艺和转瓶培养工艺分别培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗的对比研究报告数据见下表1-1。
表1-1两种不同毒株的悬浮工艺与转瓶工艺的比较
试验中，与转瓶培养工艺相比，悬浮培养工艺生产的病毒s的含量明显较高，并且生产的各批疫苗安全性符合规程标准，田间安全试验检测结果显示发生疫苗副反应的概率低于转瓶培养工艺，具有良好的市场推广效果。悬浮培养工艺生产的疫苗效力抽检检验结果显示符合规程标准，同时效力稳定，悬浮培养抗原对口蹄疫制苗毒株的免疫原性没有改变。在配制疫苗的过程中，传统转瓶方式生产高效力疫苗需要浓缩，而悬浮培养的病毒原液可稀释5-10倍进行制备，并且相应的杂蛋白及内毒素含量较低，对于疫苗的不良反应的改善具有重要作用。
笔者实验室结合实践，针对悬浮培养工艺与转瓶培养工艺生产口蹄疫的效益进行简单对比，悬浮培养工艺生产的产品成本、产品质量和安全性明显优于转瓶，具体结果见表1-2。
表1-2悬浮培养工艺和转瓶培养工艺生产效果对比
此外，全悬浮培养动物细胞与微载体悬浮培养动物细胞相比，前者生长环境更为均一，对细胞及其生长环境可以直接监测和调控，培养工艺参数的放大原理和过程控制比其它系统更易理解和掌握，因此全悬浮培养已经成为世界上动物细胞大规模培养的主流方式，其技术上的主要困难在于如何提高细胞浓度以提高产物浓度，目前主要通过优化细胞培养基和生产工艺进行改进。
1.2.2微载体悬浮培养贴壁细胞
年VanWezel开发了微载体，对于贴壁细胞实现悬浮化、高密度培养具有划时代意义。随后多种贴壁细胞实现在生物反应器中大规模培养，当前产业化中一次性培养规模已达到L。虽然微载体悬浮培养时存在细胞和球体接触部位营养环境较差，培养、取样观察及放大工艺复杂，成本高；但微载体悬浮培养方式也有自身优势，如能够实现细胞高密度培养，适宜于生产一些蛋白活性较低或是分泌型产品，产品的连续收获工艺简单可控；并且与转瓶培养相比有很大优势，能提高生产规模、产品质量和劳动效率。
目前有多种材料用于微载体的生产，常见的是纤维素、葡聚糖、胶原（明胶）、丙烯酰胺和糖胺聚糖（glycosaminoglycans）等，这些物质能够形成各种不同的形状，最常见的是球形，但是也能见到纤维状，片状，平盘状，波浪盘状和管状。目前常用的商业化微载体主要有以下几种：
1）Cytodex系列微载体
Cytodex系列微载体主要包括Cytodex1和Cytodex3，两者均是以交联葡聚糖为基质，其中Cytodex1用带正电荷的N，N-二乙基氨基乙基（DEAE）基团进行一定程度的取代以适合于细胞的生长，带电基团贯穿整个微载体基质；而Cytodex3表面有一个与交联葡聚糖基质共价连接的变性胶原蛋白层，增加了细胞在微载体上的贴附能力，二者的部分区别见下表1-3。Cytodex微载体是最普遍应用的细胞培养表面，凡是能在体外贴壁的细胞将都能够粘附到Cytodex微载体上进行贴壁培养，是在搅拌式生物反应器中进行贴壁细胞培养的主流培养介质。根据生物反应器的结构及生产工艺不同，通常工业化使用范围在2-25g/L。
表1-3Cytodex1和Cytodex3的特点
2）Cytopore微载体
Cytopore微载体是由交联纤维素（棉籽绒）构成，平均孔径为30um，具有90％以上的孔隙率。与Cytodex微载体相似，该微载体也是多微孔的，并将DEAE基团引入到了纤维素上从而具有亲水性。Cytopore微载体在细胞培养中的主要应用领域是在CHO细胞、BHK21细胞、NS0细胞和杂交瘤细胞中生产重组产品和单克隆抗体，工业化使用范围是2-8g/L，由于它的大孔性，Cytopore微载体不仅适合于贴壁依赖型细胞的培养，也适合于悬浮或者半贴壁细胞的培养。
3）Cytoline大孔微载体
Cytoline微载体是由硅土增重的高密度聚乙烯构成，具有聚乙烯带来的疏水性和硅土带来的亲水性，主要应用于流化床灌注培养中培养CHO细胞、贴壁和半贴壁细胞生产重组蛋白和单克隆抗体。Cytoline微载体包括两种类型，Cytoline1和Cytoline2，其中Cytoline1由于沉降速率高而不能用于搅拌式生物反应器，适合于最终要达到较高细胞密度的细胞培养工艺，因为需要高的氧气传递率，例如在流化床中培养贴壁或者半贴壁的细胞时有95％左右的情况都是选择Cytoline1微载体；Cytoline2适合于粘附不牢、需要低剪切力的细胞的培养，可以用于搅拌式生物反应器。它们的工业化使用范围是-g/L。
4）FibraDisk载体
FibraDisk载体是直径6mm的无纺聚酯纤维圆片，比表面积约cm2/g，使用范围是10-40g/L，使用时固定于生物反应器中，不因为搅拌而跟随细胞培养液一起运动。该载体多应用于如美国NBS的CelliGenPlus细胞培养篮式搅拌生物反应器，细胞贴附于其固定表面生长，比较容易更换培养液，不需要特殊的分离细胞和培养液的设备。但是该载体培养细胞放大较困难，并且不能直接监控细胞的生长情况（细胞计数较为困难），多用于制备用量较小、价值较高的生物制品。
细胞成功地在微载体上扩展的能力随细胞系和细胞培养基不同而变化。为特定细胞选择合适的微载体比选择微载体本身更重要。选择合适的微载体对细胞附着、细胞的进一步扩展和产品的表达有较大的影响。
微载体特性不同其应用也不同。基于多孔微载体的填充床式生物反应器在大规模工业化培养时有一定局限，不能直接使用该载体上的细胞为更大一级生物反应器接种，难以实现生物反应器间的扩大培养，限制了该种生物反应器的生产用规模。包埋培养用生物反应器适宜的载体是DISK微载体和多孔的Cytopore微载体，但是由于细胞贴附于DISK或是Cytopore载体内部生长，载体表面的细胞较少，无法使用细胞消化等方法将载体和细胞进行分离，降低了细胞的转移速度，因此不能实现罐倒罐的生物反应器放大工艺，不适合非释放病毒的培养，如甲肝病毒。而Cytodex1和Cytodex3有更快的细胞转移速度，在搅拌式生物反应器中，细胞的球转球过程可在微载体之间完成，适应罐倒罐的生物反应器放大工艺。
国际上广泛使用的细胞培养用生物反应器是搅拌式，可用于悬浮的微载体进行贴壁细胞的悬浮培养。对于搅拌式生物反应器，微载体培养细胞的效果主要由生物反应器的设计所决定，应尽可能的降低搅拌的剪切力。因此通常使用实心微载体作为搅拌式生物反应器培养贴壁细胞用载体，使用最为广泛的即是Cytodex1微载体，对于小规模生产，DISK载体也较为常用，与10L的转瓶相比，二者提供的比表面积优势明显。
表1-4Cytodex1载体与DISK载体的参数区别
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