随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的迅速发展，CRISPR文库筛选已在药物筛选、病毒感染以及肿瘤功能性基因筛选的实验中发挥重要作用。相比cdna文库与RNAi文库，CRISPR文库筛选具有多功能性、低噪声、高敲除效率、以及脱靶率低等优点，如今已成为科学家们的热门选题。
CRISPR文库筛选是什么？
简单来说，crispr基因文库筛选其实就是用来精准筛选出所需要的功能基因的。
双载体文库和单载体文库的区别？
单质粒系统：包括了启动子、gRNA、Cas9以及筛选标记，可以同时转入gRNA和Cas9，但是由于单质粒系统过于庞大导致感染效率较低。
双质粒系统：只包括gRNA和最佳启动子，只需要构建稳定表达Cas9的细胞株就可以了，双质粒系统效率更高，修改更方便，但需要转染两次。
今天我们来介绍一下基于双载体系统的CRISPR文库筛选流程以及注意事项，满满干货，看下去吧！
实验步骤
一.Cas9稳转株构建：
（1）Cas9慢病毒包装（2）慢病毒转染和Cas9阳性单克隆细胞筛选（3）Cas9活性验证
二.sgRNA文库构建（现货或定制）
针对某个物种，每个基因设计合成3-6条sgRNA，组装克隆到骨架载体，再进行扩增验证。
三.sgRNA慢病毒文库包装
（1）将sgRNA文库质粒与包装辅助质粒转染混合物缓慢加入T细胞培养瓶。（2）48h后收集培养上清，分装保存在-80℃冰箱。
四．慢病毒转染（以A细胞为例）
（1）针对A绘制嘌呤霉素杀伤曲线，确定筛选所需要的嘌呤霉素最佳浓度。
（2）将慢病毒文库以MOI为0.3的剂量感染2×个A-Cas9细胞，相当于6×细胞被感染，也即文库中的每种sgRNA会被整合到个细胞中。
五.细胞表型筛选（以A细胞为例）
将全基因组敲除细胞库分成两份
（1）其中一份作为实验组施加筛选压力，如：病毒侵染，药物治疗等；
（2）另一份作为对照组。根据耐药性、增殖能力、存活能力等表型筛选细胞。
注：根据筛选目的不同，分为阳性筛选和阴性筛选。一般3组对照和三组样品。
六.NGS测序与数据分析
将实验组和对照组的细胞分别进行：（1）抽提基因组（2）PCR扩增sgRNA片段（3）进行NGS测序（4）生物信息学分析。
七.基因功能验证
从实验的必要性和充分性两个方面进行基因功能验证。
（1）敲除单个候选基因（2）过表达/回补实验。
CRISPR文库筛选流程注意事项：
CRISPR文库筛选成功的关键有以下几点
（1）选择敲除效率高的细胞系，是保证获得高覆盖率敲除细胞文库的关键。
（2）筛选范围：对于高通量筛选，文库的大小是影响筛选结果的关键因素之一。尽量选择小文库，优先选用现货文库
（3）慢病毒转染细胞时，确保每个细胞只进入一个病毒。
以上就是CRISPR文库筛选的所有流程，看完是不是觉得自己又可以了。
