CRISPR/Cas9文库进行曲
各位宝宝们是否已经等不及想知道如何更好地使用CRISPR文库完成科研项目？不着急，当要使用CRISPR文库做全基因组筛选时，为了筛选工作顺利的进行，我们首先要清楚两个问题。
First，whichCRISPRsingleguideRNA(sgRNA)librarytouse?
如何选择一个合适的CRISPR-sgRNA文库？这是一个关键问题。
回答这个问题，需要进一步深入了解CRISPR/Cas9文库的类型，CRISPR/Cas9文库大致可以分为两类，全基因组文库（pooledsgRNAlibrary）和亚文库（subsgRNAlibrary）。
CRISPR/Cas9全基因组文库用于基因表达修饰的大致有三种类型：分别是基因敲除（knockout）、基因抑制（CRISPRi）和基因激活（CRISPRa）。
CRISPRknockout文库利用cas9蛋白切割sgRNA靶向基因，实现基因敲除，从而研究基因型和表型的关系（图一）。例如，需要鉴定某一种明确的蛋白，如病毒受体，可能需要全部的去除这种蛋白，因此，需要进行全基因的敲除。这种情况下，我们就需要借助CRISPRknockout文库。
图一：CRISPRknockout文库原理
最常见的用于体外筛选的CRISPRsgRNA基因敲除文库主要有两种：分别构建于Sabatini/Lander和张峰实验室。Sabatini/Lander等推出的最新版本的sgRNAknockout文库靶向人类基因组多个基因。张峰实验室推出的人类基因组CRISPRknockout文库（GeCKO）另外还涵盖了靶向多个microRNAs的sgRNAs。两个实验室推出的文库各有优势：Sabatini/Lander实验室在构建文库时优化了sgRNA的设计规则，可以大大增加剪切效率和降低脱靶的概率；而张峰实验室构建的文库具有多样性：单质粒文库和双质粒文库，其中双质粒文库可以在包装病毒时获取更高的滴度，并且双质粒系统可以实现Cas9细胞稳定株构建，简化实验流程。
CRISPRi文库在CRISPRi文库系统中将Cas9蛋白切割域突变，使得Cas9蛋白失去对DNA的切割活性，但不影响其与DNA结合的能力。失去DNA切割活性的Cas9蛋白成为DeadCas9（dCas9）。当dCas9和gRNA在细胞中共表达时，gRNA可以介导dCas9蛋白与DNA结合（图二）。如果dCas9结合到靶基因的阅读框内，则可阻断RNA聚合酶的延伸，如果dCas9结合到靶基因的启动子区则可以阻断基因转录的起始，从而抑制转录的进行。
图二：CRISPRi文库原理
CRISPRa文库CRISPRa文库可以用于基因功能获得性研究。与CRISPRi相同，在CRISPRa文库中，cas9蛋白失去剪切活性，但是保留与DNA的结合能力，不同的是，在CRISPRa文库中，Cas9蛋白会携带转录激活蛋白（图三）。因此，在sgRNA的指引下，携带转录激活功能的cas9蛋白将定位到目的基因的启动子区域，并发挥转录激活作用。
图三：CRISPRa文库原理
在张峰实验室推出的SynergisticActivationMediator(SAM)文库即商品化的CRISPRa文库。CRISPRSAM文库以VP64作为转录激活蛋白，与dCas9融合表达，融合表达的dCas9-VP64蛋白在sgRNA的引导下发挥其功能。研究数据表明，CRISPRa文库系统可以有效提高靶标基因的表达量，高达40倍。
除了全基因组文库，根据研究者感兴趣的领域，也衍生出了一些亚文库，这些文库靶向某一类型的基因而设计，会相对较小，因此在后期细胞或动物筛选过程中会更加快捷、简便，目的性更强。
所以，对症下药，根据研究需求选择合适的文库是科研成功的首要因素！
Second，Whichcelllinetochoose?
根据科研需求，选择合适的CRISPR文库，紧接着第二个重要的选择是细胞系。
对于细胞系的选择有非常多的干扰因素，其中有四个非常重要的考虑点，请跟着小花的步伐一起来深入了解一下吧~~~·
细胞遗传基因座类型例如人类细胞大多数都是二倍体，因此每个基因有2个拷贝。然而，很多癌症细胞染色体复杂，基因的拷贝数不确定。而很多基因组操作的效率都依赖于被修饰靶标基因的基因座类型。
细胞DSBs的DNA修复途径依CRISPR敲除原理可知，sgRNA会引导cas9蛋白到DNA的特殊位置，并且导致DNA双链断裂（DSBs）。细胞DNA双链断裂修复有两种途径：同源定向修复（HDR）和非同源末端修复（NHEJ）（图四）。
图四：DNA双链断裂修复途径和原理
研究显示，NHEJ修复会导致小片段的插入或删除（indels），在编码序列上存在indels会导致移码突变或者引起蛋白过早终止转录，将会导致蛋白的终止翻译。HDR修复以同源片段作为模板，完成基因修复，导致基因恢复完整。如果所选细胞系这两种修复途径均存在，那么由于两条途径均会修复DSBs（HDR修复可还原基因），因此，基因敲除效率会降低。
很多癌细胞系中HDR途径被部分或者全部破坏，只能按照NHEJ方式进行修复，在这样的细胞系中，CRISPR敲除文库产生完整的基因敲除细胞系具有更高的成功率。
细胞系对于筛选试剂的敏感度图五：细胞筛选
需要确认细胞系对选择试剂的敏感度，并对待选细胞系进行敏感度排序，确定最终所选细胞系（图五）。
明确敏感度的细胞系不需要高浓度选择试剂就可以在双倍时间内显示细胞的功能缺失或者改变。另外还有很多特殊细胞系，需要更高浓度的选择试剂来鉴定基因的亚表型。
细胞系的转染效率细胞系感染病毒的能力（一个或多个）直接决定了文库筛选的成功性。低感染效率的细胞系会增加文库筛选的困难程度，并且会增加筛选失败的可能性。
慢病毒的sgRNA文库，通常转染的MOI值大概是0.4-0.6（每个细胞0.4-0.6个病毒转导单位）以确保每个细胞含有单一的sgRNA。（当然，满足MOI的病毒量取决于病毒的滴度和所选细胞系的感染效率。）
搞定这两个问题后，各位宝宝针对自己的研究目的，选择合适的CRISPR文库和细胞系，开始设计实验吧。。。
对于文库质量的选择，后面还有两个非常重要的质控点（购买文库所在公司对文库的设计和构建是否完善通过文库使用，确定使用的细胞数、MOI和NGS的深度），敬请中医白癜风什么是白癜风
