H2DCFDA工作液的配制
1、储存液的配制：用DMSO配制10mM的H2DCFDA(2,×)，如用1.03mLDMSO溶解5mgH2DCFDA。
注：H2DCFDA储存液建议分装后-20℃避光冻存，一个月。-80半年。2、工作液的配制：用预热好的无血清细胞培养基或缓冲液(如PBS)稀释储存液，配制终浓度为5-10μM的H2DCFDA工作液(1×)。注：H2DCFDA工作液建议现用现配，具体浓度可根据实际情况调整。
细胞染色
■悬浮细胞a)以6孔板为例，接种适量数目的细胞，37℃，培养过夜。b)细胞密度达到80%-90%后，进行染色处理或阳性/阴性对照处理(选做)。c)阴性对照(选做):用预热的1mLPBS清洗细胞2-3次后，用新鲜制备的5mMNAC37℃处理1小时（或0.1mMH2O2作为阴性对照，37℃处理20-30分钟）。d)去除培养细胞的培养基直至无残留，每孔添加1mL1×H2DCFDA工作液，37℃细胞培养箱内孵育30分钟。e)g，4℃离心3-4分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。f)PBS再次清洗细胞，以充分去除未进入细胞内的H2DCFDA。g)加入1mL无血清细胞培养基或PBS重悬细胞，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光酶标仪或流式细胞仪分析(Ex/Em=/nm)。
图1.悬浮与贴壁细胞染色流程图(有对照)。
■贴壁细胞注：若用荧光分光光度计或流式细胞仪检测贴壁细胞，可先对贴壁细胞进行消化、收集，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。哺乳细胞染色：以Photodynamictherapyinducesautophagy-mediatedcelldeathinhumancolorectalcancercellsviaactivationoftheROS/JNKsignalingpathway一文中探针使用为例，研究者先使用m-THPC或Verteporfin处理HCT细胞，然后使用H2DCFDA染色，并通过流式细胞术测量ROS的产生。如图所示，HCT细胞中ROS的产生以时间依赖性方式增加。
图2.HTC细胞用0.35μMVerteporfin处理，流式细胞术检测ROS水平[1]
植物细胞染色：以FERONIAreceptorkinase-regulatedreactiveoxygenspeciesmediateself-in
