刚接手细胞培养的童鞋们往往懵懂，虽然师兄师姐向你传授了如何养细胞，但你是否知道细胞所需营养物质的功效是什么？你是否了解如何选择合适的细胞？“手把手教你养细胞”的第四部分将介绍细胞培养的基本知识，包括：选择适合的细胞系、细胞培养过程中的培养基要求、贴壁培养与悬浮培养，希望大家看完之后，再养细胞就养的清清楚楚，明明白白了。
01细胞系选择合适的细胞系
选择适合自己实验的细胞系时应注意以下标准。
?种属：非人类和非灵长类动物细胞系通常生物安全性限制较少，但是你要开展的实验将最终决定是否要使用种属特异性培养物。
?功能特性：你实验的目的是什么？例如：肝脏和肾脏来源的细胞系可能更适合做毒性测试。
?有限细胞系还是连续细胞系：虽然选择有限细胞系会使你在表达正常功能时有更多的选择，但是连续细胞系往往更容易扩增和维持。
?正常还是转化细胞：转化细胞系通常生长速度较快，接种效率较高，且可连续培养，培养基中需要的血清较少，但是由于遗传转化，其表型已经发生了永久性变化。
?生长条件和特性：你对细胞生长速度、饱和密度、克隆形成率以及悬浮生长能力有何要求？例如：要大量表达重组蛋白，你可能应选择生长迅速且能悬浮生长的细胞系。
?其他标准：如果你使用的是有限细胞系，那么细胞储备充足吗？细胞系的性质明确吗？需要自己进行验证吗？如果你使用的是正常细胞系，你有等效的正常细胞系可以作为对照吗？细胞系稳定吗？如果不稳定，那么这种细胞容易扩增以便为实验提供充足的冻存储备吗？
获取细胞系
获取细胞系有几种主流途经。
?通过原代细胞建立自己的培养系，比如从孕鼠中获取小鼠胚胎成纤维细胞（MEF细胞），每每说到这里，小编都觉得很伤感，想当年为了完成博士论文，亲手了结了很多鼠妈妈和鼠宝宝，曾几何时，边做实验嘴里边念叨着：“可怜的小老鼠，这都是老板的意思，算账找他算，不要来找我啊!”，哈哈，此处有同感的童鞋们记得点赞哦！
?选择从商业供应商或者非盈利性供应单位(即细胞库)处购买已经建立的细胞系。声誉良好的供应单位可提供优质的细胞系，而且会认真地对细胞系进行检测，以确保其完好性，并且未被污染。
?从隔壁实验室借用细胞。其实小编不建议这么做，因为这会带来很高的污染风险，实验室人杂手杂，你能保证每个人都操作规范吗？能保证细胞处在最佳状态吗？（题外话：想知道细胞面临的各种威胁吗？请回复数字“5”了解详情）。万一有个不小心，你拿来的细胞不靠谱，那你接下来的努力就会付之东流啊！伤不起呀，伤不起！
?无论来源如何，使用细胞之前都应确保所有新到细胞系已经过支原体污染检测。
02培养环境细胞培养的一大优势在于能够控制细胞生长的物理化学环境(即：温度、pH值、渗透压、O2和CO2压力)和生理环境(即：激素和营养素浓度)。除温度外，培养环境均由生长培养基控制。
虽然细胞培养的生理环境不如其物理化学环境明确，但是通过对血清成分更好地了解、确定细胞增殖所需的生长因子以及更好地了解培养过程中的细胞微环境(即：细胞间相互作用、气体扩散、细胞-基质相互作用)，现在可以采用无血清培养基进行一些细胞系的培养。
贴壁培养与悬浮培养
目前主要有两种基本的细胞培养体系，一种是使细胞在人工基质上单层生长(即：贴壁培养)，另一种是使细胞在培养基中自由漂浮生长(悬浮培养)。除造血细胞系和其他一些细胞外，大多数脊椎动物细胞均具有贴壁依赖性，必须在合适的基质上培养，且该基质必须经过特殊处理，以便细胞粘附和伸展(即：组织培养处理)。但是，许多细胞系也可采用悬浮培养。大多数商品化的昆虫细胞系在单层和悬浮培养体系中均能很好地生长。
悬浮培养细胞可在未经组织培养处理的培养瓶中培养，但是培养容量表面积比(通常为0.2–0.5mL/cm2)的增加，阻碍了有效的气体交换，因此需要对培养基进行搅动。这种搅动一般通过磁力搅拌器或者转瓶实现。
培养基
培养基是培养环境中最重要的成分，因为它可提供细胞生长所必需的营养素、生长因子和激素，并能调节培养体系的pH值和渗透压。
尽管早期的细胞培养实验采用从组织提取物和体液中获得的天然培养基进行，但是由于要对培养条件进行标准化、提高培养基质量以及需要量的增加，促使人们开发出成分确定的培养基。目前主要有三种培养基，即：基础培养基、减血清培养基和无血清培养基，三者对血清添加量的要求不同。
?血清是基础培养基中极为重要的细胞生长和粘附因子、激素、脂质和矿物质来源。此外，血清还可调节细胞膜通透性，并可作为向细胞内运送脂质、酶、微量营养素和微量元素的载体。但是，在培养基中添加血清也有一些缺点，包括：成本高，存在标准化、特异性和变异性问题，具有一些不良效应，例如：可促进或抑制某些细胞的生长和/或功能。如果血清供应单位的声誉不够好，那么血清的污染也会对细胞培养实验的成功造成严重威胁。
?基础培养基
大多数细胞系均可在基础培养基中生长良好，基础培养基中含有氨基酸、维生素、无机盐和碳源(如葡萄糖)，它们的主要作用如下所示，但是这种基础培养基配方中必须添加血清。
-氨基酸：组成蛋白质的基本单位。不同的细胞对氨基酸的需求各异，但几种必需氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，如组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等。
其余非必需氨基酸，细胞可以自己合成，或通过转氨作用由其他物质转化而来。绝大部分细胞对谷氨酰胺有较高的要求，因为谷氨酰胺是作为能源及碳源物质同时被细胞利用，是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡，所以各种培养液中都含有较多的谷氨酰胺。细胞所能利用的氨基酸是L型同分异构体，D型氨基酸不能被利用。
-维生素：维持细胞生长的一种生物活性物质，对细胞代谢有重大作用。它们在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，没有它们，酶便没有活性，代谢活动将无法进行。维生素分为水溶和脂溶两大类，水溶性维生素有：B族维生素、胆碱、叶酸、肌醇等，脂溶性维生素有：维生素A、D、E、K等。有的培养液中直接采用ATP和辅酶A。
-葡萄糖：大部分培养基都以葡萄糖作为能量来源之一。（是主要作为碳源利用的）
-无机盐：维持培养基渗透压平衡，参与细胞的代谢活动，主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+等
-L-谷氨酰胺：在细胞培养液中L-谷氨酰胺是大部分细胞培养基的基本成分；脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L－谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。L-谷氨酰胺是一种并不稳定的氨基酸，在中性的水溶液中会自发降解,半衰期一般为3weeksat4oC,5daysat37oC
-酚红：在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色
-HEPES缓冲系统：用来增加pH缓冲能力。HEPES在pH7.2-7.4之间有很强的缓冲能力，当透气的培养器皿被拿到二氧化碳培养箱外面的时候，由于空气中二氧化碳浓度很低，培养液中碳酸盐缓冲系统就会失去效果，这时候HEPES缓冲系统就能继续保持pH的稳定。因此，培养基中的HEPES可抵抗细胞代谢和培养环境改变引起的pH值波动。该培养基适用于稳定敏感性细胞培养体系的pH值。
?减血清培养基
减少血清对细胞培养实验不良效应的另一种策略是使用减血清培养基。减血清培养基是一种补充了营养素和动物来源因子从而降低了血清需要量的基础培养基配方。
?无血清培养基
无血清培养基(SFM)通过用适当的营养和激素成分代替血清，避免了使用动物血清带来的问题。无血清培养基配方可用于多种原代细胞和细胞系，包括：用于重组蛋白生产的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、各种杂交瘤细胞系、Sf9和Sf21昆虫(草地贪夜蛾)细胞系以及用于病毒生产宿主细胞系(例如：、VERO、MDCK、MDBK)等。使用无血清培养基的一大优势是可通过适当的生长因子组合使培养基对特定细胞种类具有选择性。下表列出了无血清培养基的优缺点
?pH值大多数正常的哺乳动物细胞系都能在pH值为7.4的环境中生长良好，而且不同细胞株间差异极小。但是，目前发现有些转化细胞系在轻度偏酸性的环境(pH7.0–7.4)中生长较好，而有些正常的成纤维细胞系更适合轻度偏碱性的环境(pH7.4–7.7)。Sf9和Sf21等昆虫细胞系最适合在pH值为6.2的环境中生长。
?二氧化碳生长培养基可控制培养体系的pH值，为培养的细胞缓冲pH值的变化。这种缓冲作用通常是通过添加有机缓冲盐(例如：HEPES)或者二氧化碳-碳酸氢盐缓冲盐实现。由于培养基的pH值取决于溶解态二氧化碳(CO2)与碳酸氢盐(HCO3–)间的精密平衡，因此空气中二氧化碳含量的变化会改变培养基的pH值。为此，使用二氧化碳-碳酸氢盐缓冲盐培养基时必须使用外源性二氧化碳，特别是使用开放式培养皿培养细胞或者进行高浓度的转化细胞系培养时。虽然大多数研究人员通常使用浓度为5–7%的二氧化碳，但是4–10%浓度的二氧化碳适用于大多数细胞培养实验。然而，每种培养基均具有其推荐的二氧化碳压力和碳酸氢盐浓度，以便达到正确的pH值和渗透压；更多信息请参阅培养基制造商提供的说明书。
?温度细胞培养的最佳温度主要取决于细胞供体的体温，此外也受到解剖部位体温差异的影响(例如：皮肤温度低于骨骼肌的温度)。与温度过低相比，细胞培养时温度过高是更为严重的问题；因此，往往将培养箱的温度设定为略低于最佳温度。
-大多数人和哺乳动物细胞系在36°C至37°C下具有最佳生长状态。
-昆虫细胞在27°C下具有最佳生长状态；在低于27°C以及27°C至30°C范围内，细胞生长较慢。温度超过30°C时，昆虫细胞活力降低，即使温度降至27°C，细胞活力也无法恢复。
-禽类细胞系在38.5°C时具有最佳生长状态。虽然此类细胞也可在37°C下培养，但其生长速度会变慢。
-来源于冷血动物(例如：两栖动物、冷水鱼)的细胞系可耐受很宽的温度范围(15°C-26°C)。
Tips:请注意每种细胞的培养条件均有所不同。偏离某种细胞所需的培养条件会导致细胞表型异常，甚至培养完全失败。因此大家应熟悉自己使用的细胞系，实验中严格遵守所有产品附带的操作说明。
03细胞形态定期检查培养细胞的形态(即：形状和外观)对于细胞培养实验取得成功至关重要。除确认细胞健康状态外，每次操作细胞时通过肉眼和显微镜检查细胞还可早期发现污染征象，避免污染扩散至实验室其他细胞。
细胞变质的征象包括核周出现颗粒、细胞与基质解离以及细胞质空泡形成。这些变质征象可能为多种原因所致，例如：培养物污染、细胞系衰老或培养基中存在毒性物质，或者这些征象仅表明培养物需要更换培养基。变质严重时将会成为不可逆的变化。
哺乳动物细胞
哺乳动物细胞形态差异根据细胞形态，可将大多数培养的哺乳动物细胞划分为三大类。
?成纤维(或成纤维细胞样)细胞为双极或多极细胞，呈细长形。它们贴附在基质上生长。
?上皮样细胞呈多角形，尺寸更为规则，贴附在基质上呈散在斑片状生长。
?淋巴母细胞样细胞呈球形，通常悬浮生长，不贴附在基质表面。
除上述基本类型外，一些细胞还可显示与其在供体中特殊功能相适应的形态特征。
?神经元细胞有多种形状和大小，但是可以粗略地划分为两个基本形态类别，I型具有很长的轴突，可长距离传递信号，II型则没有轴突。典型的神经元会从胞体部发出具有许多分支的细胞伸展结构，因此被称为树突树。神经元细胞可以是单极或假单极细胞，即：树突和轴突发自同一突起，可以是双极细胞，即：轴突和单个树突发自胞体(有核细胞的中心部分)上相对的两端，也可以是多极细胞，即：细胞具有两个以上的树突。
昆虫细胞
Sf21细胞的形态
Sf21细胞(IPLB-Sf21-AE)是从草地贪夜蛾(秋粘虫)分离得到的卵巢细胞。该细胞为球形，大小不等，略呈颗粒状外观。Sf21细胞可解冻后直接悬浮培养，用于细胞库的快速扩增、杆状病毒库的扩增和重组蛋白的生产。由于Sf21细胞与支持物表面贴附牢固，因此可通过单层培养用于转染或菌斑试验。下图显示了悬浮培养(图3.3)以及贴壁培养达到汇合状态时(图3.4)的健康Sf21昆虫细胞形态。请注意昆虫细胞达到汇合状态时即应进行传代
Sf9细胞的形态
Sf9昆虫细胞系是来自草地贪夜蛾IPLB-Sf21-AE亲本细胞系的克隆分离株，它是利用杆状病毒表达系统(例如：Invitrogen的Bac-to-BacR和Bac-N-Blue?表达系统)进行重组蛋白表达的合适宿主。虽然以往人们利用由培养角瓶和含血清基础培养基组成的静止培养系统进行昆虫细胞的培养，但是一般而言昆虫细胞并无贴壁依赖性，便于进行悬浮培养。
下图显示了悬浮培养和贴壁培养的健康Sf9昆虫细胞形态。Sf9细胞与支持物表面贴附牢固，而且体积小、形状规则，因而非常适合形成细胞单层和空斑。
看完了上面细胞培养基本常识的介绍，大家是否对细胞培养有了新的认识呢？细胞培养的另一重要环节——传代和冻存，又有哪些吐槽点呢？咱们下周三见！
以上内容部分选摘自《细胞培养基本知识手册》
编辑：生物试剂耗材商城
