细胞DNA合成检测（BrdU、EdU）
细胞增殖相关抗原检测
ATP浓度检测
一、DNA合成检测
通过测定分裂的细胞DNA含量，直接反应细胞的增殖能力，以最常见的BrdU和EdU为例[1]。它们的基本原理相似，作为胸腺嘧啶的衍生物，可以参与到DNA复制中，代替正常的胸腺嘧啶（T），进而通过抗体或者荧光标记等方式检测，进而反应DNA的含量。下面具体看一下这两种方法上的不同及其特点。
1.BrdU插入
方法：基于BrdU特异性抗体检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力
实验步骤：孵育细胞→加入BrdU工作液→甲醇/醋酸固定细胞及DNA变性→孵育加1抗即抗BrdU单抗（工作浓度1：50）→加HRP标记的二抗→显色。
实验步骤
来源于abcam：BrdUCellProliferationELISAKit(colorimetric)）
数据分析：如下图：通过ELISA方式检测BrdU标记的细胞，发现ELISAOD值在一定范围内有良好的线性关系；未加入BrdU不能检测到信号；H2O2处理细胞后抑制增殖。
BrdU通过ELISA方式检测
缺点：
由于抗体分子量大，难于掺入并被有效检测，需要进行DNA变性；
BrdU检测需要孵育BrdU单抗和带标记的二抗，时间长甚至过夜；
BrdU会肌体造成不可逆损伤，使用时注意安全，避免吸入BrdU粉尘。
2.EdU插入
方法：通过EdU与Apollo荧光染料的共轭反应，使得染料标记到EdU插入的增殖中的细胞，进而快速检测细胞DNA复制活性。
实验步骤：孵育细胞→加入EdU→固定细胞→加染料→荧光检测
数据分析：下图利用荧光显微镜，对EdU标记的各个细胞（图1）或不同的组织（图2）均能识别，起到标记增值中细胞DNA的作用。其中蓝色代表细胞核（DPAI）。
上图源于：Cell-Light?EdU荧光显微镜检测试剂盒说明书
优点：与BrdU检测方法相比，EdU：
更快速：只需2.5h，无需抗原抗体反应；
更灵敏：EdU染料只有BrdU抗体的1/，在细胞内很容易扩散；
更准确：无需DNA变性，能在细胞和组织水平更准确地反映DNA复制活性。
二、细胞增殖相关抗原检测
检测增殖细胞特异性地表达某些特定蛋白，如Ki-67，PCNA只存在于增殖细胞中，而非增殖细胞缺乏这些抗原，因此常作为细胞增殖的标志。
实验过程：即免疫组化过程，基于一抗二抗孵育原理，由于比较繁琐，我们后期会单独介绍。
数据分析：如下图对癌组织进行的Ki67和PCNA染色，褐色代表Ki67和PCNA的表达，可见药物处理后，Ki67和PCNA表达降低，即细胞增殖能力降低。
免疫组化检测肿瘤组织Ki67的表达[2]
免疫组化检测肿瘤组织PCNA的表达
三、ATP浓度检测
原理：ATP是细胞能量的直接来源，死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP，在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。
方法：目前应用最广的方法：基于萤火虫荧光素酶催化荧光素氧化，消耗ATP。发光量与ATP含量呈很好的线性关系，反应如图显示：
实验步骤：
1.样品测定的准备：按照说明书加入专用裂解液，冰上裂解后离心去上清；
2.标准曲线测定的准备：ATP标准溶液用ATP检测裂解液稀释成适当的浓度梯度；
3.ATP检测工作液的配制：按照每个样品或标准品需μL的ATP检测工作液的比例；
4.ATP浓度的测定：
加μL的ATP检测工作液到检测孔或检测管内。室温放置3-5min，以使本底性的ATP全部被消耗掉，从而降低本底；
在检测孔或检测管内加上10-μL样品或标准品，迅速用枪(微量移液器)混匀，至少间隔2s后，立即用luminometer仪测定RLU值或CPM。如果样品中ATP的浓度特别高，可以用MilliQ级的纯水或重蒸水稀释样品后再测定；
根据标准曲线计算出样品中ATP的浓度；
为了消除样品制备时由于蛋白量的差异而造成的误差，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品中的蛋白浓度，然后把ATP的浓度换算成nmol/mg蛋白的形式。
5.根据ATP与处理组方案如药物浓度绘制曲线。
数据分析：如图：HepG2细胞经不同浓度Tamoxifen处理后，经过ATP检测试剂盒得到的荧光值与药物拟合的曲线；要注意的是ATP检测试剂孵育时间不能过长，否则会影响实验准确性。
药物处理后的HepG2细胞的ATP曲线[3]
那么在这2期的四种方法中，我们如何选择呢？这主要取决于您的实验目的和细胞类型及数目。
若直接测细胞增殖：可用BrdU或EdU标记法，其中EdU更加快捷准确。
如研究细胞的代谢活性：那么直接选择比色法检测，即MTS、CCK8及SRB法等；
若是高通量的药物筛选：悬浮细胞推荐采用MTS，CCK-8这两种方法，操作较为简单；若是贴壁细胞推荐SRB法，不受时间限制，且有很好的线性关系。
但若药物带有颜色：药物的高通量筛选，且药物处理时间较短，带有颜色，推荐采用基于ATP的检测方法。
细胞类型：如果是悬浮细胞，不适合SRB和MTT，推荐使用MTS和CCK8法。
研究单个细胞：适合选择BrdU或EdU标记法，不适合比色法。
研究少量细胞：如果细胞数少于，则推荐使用基于ATP的检测方法；
若对细胞增殖及代谢等多个方面感兴趣：可以通过多种方法来验证，如可以选择用BrdU标记，再通过比色法、化学发光或荧光检测进行分析。
通过这2期的学习，相信大家对细胞增殖的检测方法有了比较系统的认识，在具体实验中，你只需要根据你的实验目的和细胞类型选择最佳的实验方案。若有任何问题，欢迎留言或者入群参与讨论。
参考文献
1.罗涛,王彤敏,李力燕.EdU与BrdU在检测细胞增殖中的特点及应用进展[J].重庆医学,,44(32):-.
2.QinM,PengS,LiuN,etal.LG,anovelsynthetic从事皮肤病白癜风治疗皮肤白癜风的治疗方法
