前言骨细胞是骨中最丰富的细胞，构成个体中所有骨组织中细胞的98％。在将编码硬骨素（SOST）的基因中的突变鉴定为伴有常染色体隐性遗传的严重进行性硬化性骨发育异常的原因之前，骨细胞一直被认为是固定在在矿化骨基质中的静止细胞，并且它们在调节骨代谢平衡中的作用被低估。有证据表明，骨细胞是主要的机械敏感性骨骼细胞类型，并且在调节成骨细胞和破骨细胞分化和功能方面具有关键作用。但是，不像成骨细胞从间充质干细胞分化，骨细胞分化所需的分子和转录调节因子相对比较有限。
microRNAs（miRNAs）在骨骼发育和体内稳态中的重要作用是在成骨细胞谱系细胞中条件敲除Dicer（一种参与miRNA加工的RNaseIII核酸内切酶）的过程中被首次注意到，条件敲除Dicer导致了胚胎致死性和矿化缺陷。随后的研究集中在了解特定miRNA在破骨细胞和成骨细胞中的生理作用。然而，miRNA在骨细胞功能和分化中的作用尚不清楚。
我们先前在骨形态发生蛋白2（BMP2）诱导的C2C12细胞系的成骨细胞分化过程中发现有20种miRNA上调，14miRNA种下调。miRNA-23a簇内的miRNA是miRNA微阵列分析中上调的miRNA的一种。该簇由miR-23a，miR-27a和miR24-2组成，它们被转录为独立的miRNA，随后被加工成三种成熟的miRNA。多项研究已经证明了这个簇在血管生成，造血，成骨和癌症发病中的重要作用。我们在研究中发现miR-23a可能参与成骨调节;然而，这个簇在骨骼发育中的作用还不清楚。
在这篇文章中我们报道了miR-23a簇在调节骨细胞分化中具有重要作用。我们应用了基因功能获得性（GOF）和功能缺失型（LOF）小鼠模型证明了miR-23a簇在成骨细胞谱系中的功能。我们应用了RNA测序（RNA-Seq）结合智能通路分析（IPA）发现转化生长因子TGF-β通路是影响GOF小鼠低骨量表型与高骨细胞密度的重要通路之一。此外，Targetscan预测结果显示Prgets16是miR-23a簇的上游调控子和直接作用位点。总体而言，我们的研究说明了miRNAmiR-23a簇能通过TGF-β通路的直接作用位点-Prdm16调节TGF-β通路从而对骨细胞分化产生影响。
结果1.鉴定骨中的miR-23a簇。（IdentificationofthemiR-23aclusterinbone.）：
miR23a簇在骨组织中高表达，上调或下调miR23a簇引起相应的骨松表型
fragmentsperkilobaseoftranscriptpermillion(FPKM).F1：用转录组测序技术测定普通小鼠颅骨组织发现miR23a簇在骨组织中高表达。RNA-seq即转录组测序技术，就是把mRNA，smallRNA，andNONcodingRNA等或者其中一些用高通量测序技术把它们的序列测出来。反映出它们的表达水平。问题：这里只给出这么一张图好像不能体现出miR23a在骨组织中高表达这个结论，可能作者没有把其他部位的结果摆出来做比较。
SF1：因为miR-23a簇由miR-23a，miR-27a和miR24-2组成，所以作者在做GOF小鼠的时候把miR-23a，miR-27a和miR24-2一起高表达了。结果发现高表达miR-23a簇的小鼠体型较正常小鼠要小，切牙有骨松表型。问题：怎么去理解作者在研究GOF小鼠的时候把miR-23a，miR-27a和miR24-2放在一起做，但是在做LOF的时候却分开做了？
SF1：可以推测体型小对骨骼应该是有影响，那是不是最好要排除这个因素？小鼠体型娇小是不是他牙口不好引起的？然后作者给正常小鼠和GOF小鼠都换了softchow，这个体重的差异就被逆转了。
SF1：最终这个GOF小鼠还是成功构建了。
SF1：那这个GOF小鼠跟正常小鼠的骨头有不同吗？作者分析了小鼠的椎骨：骨松表型
SF2：那这个GOF小鼠跟正常小鼠的在股骨上有区别吗：差别不明显，只有在雌鼠的BV/TV和Tb.Th这两个指标上有差异
SF1：GOF（功能获得型）小鼠研究了，接下来要研究一下功能缺失了会怎么样
F1SF4,5：a代表miR-23a，b代表miR-27a，c代表miR24-2，可以发现miR-23a，miR-27a的缺失引起了骨量的变化，但是miR24-2对骨没有明显的作用。
SF3：作者又对miR-23a，miR-27a和miR24-2的LOF小鼠的骨皮质做了分析，结果没差别。
SF6：把miR-23a，miR-27a跟miR-23a簇对比，miR-23a，miR-27a的LOF小鼠跟miR-23a簇LOF小鼠表型相似。
?2.miR-23a簇影响骨细胞分化。（ThemiR-23aclusteraffectsosteocytedifferentiation.）：
miR23a簇在骨组织中高表达，上调或下调miR23a簇引起相应的骨松表型
F2：在甲苯胺蓝椎体切片染色中显示miR-23a簇GOF小鼠的OB数量明显下降在钙黄绿素双标的结果中显示miR-23a簇GOF小鼠的矿化沉积率（MAR）和骨矿化周长（MS/BS）明显下降，即成骨减弱
F2：但是在TRAP染色的结果中两种小鼠OC的数量没有统计学差异。前两图说明GOF小鼠的骨量低下是由于成骨减弱而不是破骨加强
F2：有趣的是，三色染色（Masson三色？）椎骨切片显示显示miR-23a簇GOT小鼠骨组织中的骨细胞却高于普通小鼠，而miR-23a，miR-27a的LOF小鼠的骨细胞密度低于普通小鼠。J：在股骨的切片中，miR-23a簇GOT小鼠骨组织中的骨细胞仍然高于普通小鼠，但是miR-23a，miR-27a的LOF小鼠的骨细胞密度与普通小鼠无明显差异。
SF7，8：虽然在股骨miR-23a，miR-27a的LOF小鼠的骨细胞密度与普通小鼠无明显差异。但是在股骨组织上miR-23a，miR-27a的LOF小鼠的骨矿化周长MS/BS却是低于WT的
SF9：而miR-23aC的GOF小鼠，miR-23a，miR-27a的LOF小鼠跟WT小鼠相比在骨皮质MAR的结果上没有差别
问题：至此，作者做出了这样一个结论ThissuggeststhatGOFofthemiR-23aclustercanregulateosteocytedifferentiationinbothtrabecularandcorticalbones.但是个人认为他只在椎体松质骨上比较好的证明了这结论，但是在股骨松质骨、皮质骨都没有很好的证明这个结论。最终作者用了这么一句话解释了一下Thismaybedueinparttothedifferentialrateofturnoverandboneformationincorticalversustrabecularboneand/ortheeffectsizeintheGOFversusLOFmodels个人认为这里的论证不足，可以再深入一点。
F2：在之前作者说明的miR-23acluster促进了骨细胞分化的基础上，下一步应该是研究其机制。那么可以推测应该会从miR-23acluster的上下游下手。有研究证明了Satb2是miR-23acluster的作用位点，所以作者针对Satb2和成骨细胞和骨细胞的一些相关因子做了一个检测。发现在miR-23aclusterGOF的小鼠的Satb2的表达明显减少（负反馈？），然后成骨的早期指标runx2，ALP，等没有明显变化，而成骨晚期指标OCN有所下降，骨细胞的指标Dmp1，Mepe,Fgf23等都有明显增高，表明miR-23aclusterGOF促进了骨细胞分化。
F2SF10：而后作者做了实验发现miR-23aclusterGOF的小鼠来源的OB的矿化能力有所减弱，并且Sost和表达明显增高，OCN的表达降低（OB过早成骨矿化减少？），然后miR-23a，miR-27a的LOF小鼠来源的OB的Sost的表达明显降低。
SF11：3月龄的GOF小鼠的SostmRNA表达升高，而miR-23a，miR-27a的LOF小鼠与正常小鼠相比没有统计学意义，作者认为这个是因为表型比较弱。
第二部分结束本来以为作者要在这一部分研究miR-23a簇的具体机制，但是发现做的内容更像是第一部分的补充，加了几个切片，感觉有点水。是不是把这里跟第一部分放在一起会更好？?3.Prdm16是miR-27a的直接靶点并且能够抑制Sost。（Prdm16isadirecttargetofmiR-27aandsuppressesSost.）：应用RNA-Seq技术找出miR-23a簇并在动物实验中证明miR-23a簇的失调能引起骨松表型后，下一步应该是要在体外实验中研究其机制了。
ST1：作者用了RNA-Seq检测了miR-23aclusterGOF小鼠和WT小鼠的OB在向OT分化的过程中有哪些因子发生了变化，结果显示有上面列出的20种因子的表达差异较大。
F3ST2：那表达差异较大较大的因子到底是属于哪些通路的呢?作者又做了IPA，发现有HpgdandCdkn1a这两个因子在TGF-β这条通路的下游，有Prdm16(alsocalledMel1)这个因子在这条通路的上游。补充：已有文献证明Prdm16能抑制TGF-β的下游基因。
F3：作者还发现Prdm16的3’非编码区有一段保守的miR-27a的结合位点。至此miR-27a，Prdm16，TGF-β，OB这条线慢慢连起来了。
F3：然后作者为了验证miR-27a和Prdm16之间的关系，把miR-27a的结合位点跟荧光素酶报告基因连在一起，在有miR-27a和没有miR-27a的两种情况下培养，发现在miR-27a的作用下GFP表达减少了，而用了miR-27adecoy后可以逆转。一定程度上证明了miR-27a和Prdm16的关系。
F3：作者又在MC3T3细胞上做了一次，结果相同。
SF10F3：那这Prdm16能逆转miR-27aC的作用，他对OB的作用怎么样呢？作者取了WT小鼠和miR-27aC小鼠的OB，并且用了Prdm16作对比。作图显示这个实验的过程是成功的，右图显示确实Prdm16逆转了miR-27aC的作用，抑制了成骨分化。
SF10:稳定表达Prdm16的MC3t3细胞在用了多西环素后Prdm16的表达明显升高。TGF-β是骨细胞分化过程中的一个重要因子能促进Sost的表达，D图说明多西环素诱导的Prdm16能够抑制TGF-β引起的Sost表达增高。
F3：作者做了一个ChIp,但是这里不知道为什么没有把原图放上去只放了一个表格。这个图其实我看的不是特别明白。CTL,controlwithoutDoxH3Ac：thehallmarkofactivetranscriptionIgg部分：对照SBE:Smad-bindingelements纵坐标是加入的CHIP-Ab能拉下来的启动子的量数据显示：Prdm16和Smad3可以结合启动Sost。第三部分结束这部分说明了Prdm16是TGF-β的负调节因子，能够通过抑制Sost的表达抑制成骨分化。?4.在GOF小鼠中TGF-β信号通路是被增强的。（TGF-bsignallingisdysregulatedinGOFmice.）：
F4：作者这里又把荧光素酶的基因整合到WT，23a簇GOF，23aLOF，27LOF小鼠TGF-β里面去了，结果发现表达的荧光量23a簇GOFWT23aLOF，27LOF小鼠。问题：对这个图我在想是不是有问题，在最上面低表达的WT到了下面两个图就高表达了，然后下面的23aLOF，27LOF小鼠的结果看起来跟最上面图的WT没什么差别。
1D11：TGF-β抗体，13C4：对照抗体F4：这里作者用了TGF-β抗体，发现不管WT还是23aC的小鼠，用了TGF-β抗体骨量都增高了。
问题：我一直认为作者想要表达的是TGF-β通路起着调控骨代谢的作用，不管TGF-β较正常上调或下调都会引起骨量下降，这里怎么就在WT用了这个抗体骨量也上升了？讨论意见：其实我觉得miR可能还有其他调控机制，不仅仅通过TGF的，TGF不是唯一通路。问题：也就是前面提出的问题：Prdm16是否是唯一调控靶点？讨论意见：应该不是唯一
SF13SF14：这两张图的结论看起来也没什么营养，就在用了1D11后破骨细胞数量下降了这个点前文没怎么讲到，其他的部分跟前面差不多。然后作者也没有再对用了1D11后破骨细胞数量下降了这个点再做阐述。第四部分结束作者最后提到mi23aC在细胞上的实验已经有人做过了，好像想说因此自己在这篇文章里面没有做很多体外实验。但是个人感觉这篇文章做的层面比较单一，ChIp的原图也没有放上来，篇幅最多的就是miR-23aCGOF小鼠，miR-27a和miR24-2的LOF小鼠的各种结果。参考文献：
1ZengHC,BaeY,DawsonBCetal.MicroRNAmiR-23aclusterpromotesosteocytedifferentiationbyregulatingTGF-betasignallinginosteoblasts.NatCommun;8:.
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