一、细胞培养
1、细胞复苏
将冻存有细胞的冻存管从－70oC冰箱中取出，迅速置于已预热37oC的水浴箱中不断摇动使冻存液在1min内解冻。在超净工作台内吸出细胞悬液并滴加在含6mlDMEM培养基的离心管中，放入离心机rpm离心6min,弃上清液，向离心管中加入DMEM培养基6ml吹打混匀制成细胞悬液种于培养瓶中,放入37oC5%CO2培养箱中继续培养，24h内换液，以除去残存冻存液和未贴壁细胞。
2、细胞培养与传代
当细胞长满培养瓶底约85%～90%时弃去原培养液，用PBS轻洗2～3次，弃去PBS，加入适量胰蛋白酶液，在倒置显微镜下观察，若胞质回缩，细胞间不再连接成片时，吸弃胰蛋白酶液，加入DMEM培养基终止消化，轻轻吹打直至细胞全部脱落悬浮，将细胞悬液吸出分装至2~3个培养瓶中，再加入适量DMEM培养基和胎牛血清，血清浓度为10%，放入培养箱中静置培养。传代第2天吸出原培养液，加入新培养液。细胞约2~3天传代1次。
3、细胞冻存
细胞冻存前一天更换培养基，观察细胞生长情况，使细胞处于指数生长期。按照细胞传代的方法收集，去少量细胞悬液在倒置显微镜下进行细胞计数。然后将细胞悬液吸入离心管，rpm离心6min，弃上清，吸取细胞冻存液，吹打混匀细胞，使细胞密度为1×个/ml，将细胞悬液吸入冻存管中严密封口，冻存管做标记。先将冻存管放入4oC冰箱30min，接着置于-20oC冰箱1h，再移入超低温冰箱中保存。
基因启动子活性区域的鉴定
1、方法
(1)DNA的提取
①细胞DNA的提取
取一瓶对数生长期的细胞，吸去上清，2mlPBS洗涤2次后，加入质量浓度0.25%胰蛋白酶消化3分钟，待细胞皱缩，彼此分离时即可中止消化。吸去消化液，加入1ml含10%胎牛血清的培养液，吹打成单细胞悬液。将细胞悬液吸入EP管，4℃，rpm，离心10min，去上清；沉淀中加入ulCellLysisSolution及ul生理盐水，混匀充分，加12ulproteinK,55℃水浴锅过夜；加入ul氯仿，颠倒混匀约5min；10rpm，离心10min后，溶液分3层，上层为水相，如水相少，则用Tip拨动后再次离心。移上层水相液ul入EP管，加入ulPrepSolution上下颠倒混匀，静置2min，10rpm，离心10min，去上清；加入ul1.2mmol/LNacl，3ulRNA酶A，混匀后37℃水浴10min；加入预冷的无水乙醇ul混匀后置-20℃放置10min；10rpm，离心10min，弃上清，加4℃预冷的70%乙醇，10rpm，离心5min，弃上清，点动离心；用Tip将余液吸尽，室内干燥10min；加70ulTE混匀，转鼓数小时后置-20℃保存。
②组织DNA抽提
（1）每1毫升样品裂解液中加入5微升蛋白酶K，混匀。
（2）对于收集好的样品，每5毫克组织中加入微升添加了蛋白酶
K的样品裂解液，Vortex混匀，充分裂解组织。
（3）50℃水浴消化过夜。
（4）加入微升Tris平衡苯酚。
（5）Vortex剧烈混匀，使有机相和水相充分混合，以达到抽提效果。4℃，12,g离心5分钟。
（6）缓慢吸出酚相及中间相(可以吸除少量靠近中间相的水相液体)，剩余的水相用等体积Tris平衡酚再抽提一次（同步骤5）。
（7）缓慢吸出酚相及中间相(可以吸除少量靠近中间相的水相液体)，剩余的水相用等体积氯仿再抽提一次（同步骤5）。
（8）慢慢吸出约微升上清液，加入60微升10M醋酸铵和微升无水乙醇，颠倒数次混匀，此时可见DNA沉淀产生。-20℃冻存1小时，以充分沉淀小片断DNA。
（9）4℃，12,g离心10分钟，弃上清。
（10）加入微升70%乙醇，轻轻颠倒约2次。4℃，12,g离心10分钟，小心吸去上清。70%乙醇注意避免损失一些细小的DNA沉淀。
（11）尽量吸除残余的乙醇，待看不到明显的液体时，立即加入50-微升TE溶解DNA。
（12）取部分抽提得到的DNA，1%琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下拍照记录结果。
（2）PCR
①PCR反应体系：
2×HiFiPCRMasterMix12.5μL
10μmol·L-1(Primer1)1.0μL
10μmol·L-1(Primer2)1.0μL
DNATemplate0.5μL
ddH2O10.0μL
──────────────────
TotalVolume25.0μL
②PCR反应条件：
94℃3min1cycle
──────────────────
94℃40s
Z℃30s30cycle
72℃XminYs
───────────────────
72℃10min1cycle
───────────────────
4℃保存
延伸温度时间（用XminYs表示）和退火温度（用Z℃表示）不同
③PCR产物的鉴定和回收纯化
PCR产物从大到小分别记作P5、P4、P3、P2，分别取少量PCR产物在v
进行1.2%琼脂糖（含EB）电泳20min，后放入凝胶成像系统观察和拍照。
（3）DNA纯化回收试剂盒
PCR产物除目标带外还有其他杂带，用DNA纯化回收试剂盒进行纯化：
先进行柱平衡处理，将吸附柱放收集管中，加μL平衡液BL入吸附柱，10rpm，离心1min，去滤液；于PCR产物中加入等体积的PC溶液混匀，转移到吸附柱，10rpm，离心1min；用μLPW溶液重复洗涤2次，最后加入35μL洗脱缓冲液EB，将目标DNA片段洗下，10rpm，离心2min。具体以说明书为准。
（4）DNA片段酶切和连接
DNA片段纯化后的PCR产物和载体质粒pGL4.10用相应的限制性内切酶处理，根据需要进行双酶切反应，采用逐一单酶切反应体系，即先用一种限制性内切酶（KpnI）体系37℃酶切1.5h，然后再用另一种限制性内切酶（XhoI）体系37℃酶切2h。
PCR产物酶切反应条件为：
PCR纯化产物30μL
10×bufferTango5μL37℃10×bufferTango6μL37℃
KpnI2μL1h30min+XhoI2μL2h
ddH2O13μL
载体质粒酶切反应条件为：
载体质粒DNA10μL
10×bufferTango3μL37℃10×bufferTango4μL37℃
KpnI1.5μL1h30min+XhoI1.5μL2h
ddH2O15μL
DNA连接：目的DNA片段/载体质粒按3:1混合，立刻置冰上2min，加入10
×T4DNAbuffer和T4-DNALigase轻混匀，加去离子水定至20μL反应体系，
22℃30min，65℃10min终止连接。
（5）转化
取50μL感受态细胞（大肠杆菌JM）与5μLDNA连接产物至离心管中轻轻混匀，冰浴静置30min，42℃水浴90s，进行细菌热休克，冰上放置2min，加入μLLB液体培养基（AMP-）混匀，rpm，37℃振荡培养1h，后取50-μL已转化的感受态细菌（菌液），涂布于LB平板（含氨苄青霉素）至干，于37℃正置培养30min后，倒置培养过夜，挑选转化子进行筛选鉴定。
（6）转化子的筛选鉴定
取4-6个15mL离心管，每管加入3.5mL含氨苄青霉素的LB细胞培养，从上一步的LB平板上用已经灭菌的Tip（中号）挑取4-6个单克隆转化子，把挑取了菌的Tip分别伸入标记好的相应的离心管溶液中轻轻吹打3次，37℃，rpm振荡培养过夜。每管依次转移3mL菌液到1.5mL的EP管内并做好标记（剩余菌液于4℃暂时保存），10rpm，离心1min，收集细菌沉淀，尽量吸弃上清；向留有菌体沉淀的EP管中加入μL溶液P1（冰预冷），用移液器彻底悬浮细菌沉淀使其分散均匀；加入μL溶液P2，温和上下翻转6～8次，以裂解细菌，待溶液变粘稠为止，用时﹤5min；加入μL溶液P3，立即温和上下翻转6～8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，10rpm，离心10min；向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入μL的平衡液BL，10rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；然后将上述的上清收集转移至吸附柱，10rpm，离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管；加μL去蛋白液PD入吸附柱，10rpm，离心1min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管；向吸附柱加入μL漂洗液PW，10rpm，离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管，此步骤重复一次；10rpm，离心2min，将吸附柱置于一个干净的EP管中，开盖室温干燥8～15min，直至乙醇充分挥发，加入80μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，10rpm，离心1min，将质粒溶液收集到EP管中，置-20℃保存。
（7）细胞培养
将细胞培养于含体积分数10%胎牛血清、U·mL-1青霉素、质量浓度μg·mL-1链霉素的DMEM完全培养基中，置于37℃体积分数5%CO2，饱和湿度条件的培养箱内，根据细胞生长速度，用质量浓度0.25%胰酶消化传代培养。
（8）基因启动子报告基因质粒转染细胞
细胞转染的前一天，将处于对数生长期的细胞用胰酶消化后，用无抗生素的DMEM培养基悬浮、计数，以每孔μL含2×个细胞的密度铺入12孔板内，37℃、5％CO2条件下培养至细胞达60%铺满。转染前吸出培养液，用PBS洗涤细胞2次，更换新鲜无双抗的优化培养基（12孔的加入μL）。转染前30min配制DNA-脂质体复合物如下（一个12孔的量）：
①取2.0μg质粒混合于无双抗的优化培养基中，终体积为μL；
②将5μLLipofectamineTM0加入另一管无双抗的优化培养基中轻混匀后静置5min，终体积为μL；
③将①和②混匀，室温静置25min后即形成DNA-脂质体复合物。
将DNA-脂质体复合物加入孔内前后轻摇混合均匀，置37℃、5%CO2的培养箱中培养6h后转染结束。取出板子吸掉旧液，加入新鲜的含抗生素和10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养42小时。24孔板细胞转染过程与12孔板基本相同，各种试剂和质粒的用量为12孔板用量的1/2即可。
（9）基因启动子活性分析
按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒的方法检测*基因启动子活性，主要操作步骤为：
转染*基因启动子报告基因质粒，同时转染内参质粒（约5-10ng）。每
个样品重复三个孔。
胞转染培养48小时后，每孔加入μL1×PLB（12孔板）裂解缓冲液，室温轻轻摇动15min，直至细胞裂解。
⑶将荧光测试仪打开，吸取μLLARⅡ检测液入1.5mLEP管中，加入20μLPLB裂解产物，轻轻吹打2-3下，混匀后，迅速用多功能检测仪检测第一荧光，即萤火虫荧光素酶活性。
⑷第一荧光检测完后，加入μLStop＆GloReagent反应液，轻轻吹打2-3下，混匀后，迅速检测第二荧光，即海肾荧光素酶活性。
⑸重复步骤⑶和⑷，检测各个样品的双荧光素酶活性。
⑹将萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性相比，比值即为*基因启动子的相对活性。
2、溶液的配制：
TE缓冲液（用于溶解DNA）：5mL1mol·L-1Tris·cl（pH8.0）、1mL0.5mol·L-1EDTA，pH8.0，定容至mL。
50×TAE缓冲液：gTris、57.1mL冰醋酸、mL0.5mol·L-1EDTA(pH8.0),加水至1L。使用前用双蒸水稀释成1×工作液。
LB培养基（用于大肠杆菌培养）：液体2.5g与ml去离子水充分溶解，倒入三角烧瓶，封口，高压下℃蒸汽灭菌20min，4℃保存。
LB平板：固体4g与ml去离子水充分溶解，倒入三角烧瓶，封口，高压下℃蒸汽灭菌20min，放入洁净操作台，冷却至50℃时加入氨苄青霉素μL混匀，倒入干净的培养皿，凝固后封口，4℃保存。
DMEM/RPMI-细胞培养液：使用前，培养基中加入终浓度为10%的胎牛血清，U·mL-1青霉素，μg·mL-1链霉素。
1×磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSaline，PBS）：在ML蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,用HCl调节溶液pH值至7.4，加水定容至1L，高压下℃蒸汽灭菌20min，常温保存。
青霉素、链霉素溶液：青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌去离子水，链霉素是万单位/瓶，加5ml灭菌去离子水，即各为20万单位/ml，溶入培养液时，使青、链霉素的浓度最终为单位/ml。所有操作均在超净工作台内完成。
冻存溶液的配制：将DMEM/RPMI-培养基：胎牛血清：二甲基亚砜7:2:1的比例混合，然后经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃避光保存。
3、所需试剂：
萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL4.10
海肾荧光素酶对照报告基因载体pRL-TK
Dual-Luciferase?ReporterAssaySystem
RNA酶
DNA提取试剂盒（ClassicGenomicDNAIsolationKit）
Tris碱、甘氨酸
Primerstar高保真DNA聚合酶（2.5U/μL）
PfuDNApolymerase
各种限制性内切酶、T4-DNA连接酶
DNAMarkerⅤ、1bp
DNAMarker0bp
DNA纯化回收试剂盒
质粒小题试剂盒
双抗（青霉素、链霉素）
NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4
胰蛋白酶消化液
DMSO
嗅化乙锭
葡萄糖
RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit
LipofectamineTM0
TrizolReagent
DMEM低糖培养液
RPMI-培养液
胎牛血清
去酶Tip
去酶EP管
1.8ml冻存管
PBS
三、高糖诱导的细胞凋亡
1、溶液配制
（1）高糖溶液的配制：
秤取9gGlucose溶于50mLPBS溶液即配成1mmol/mL的高糖母液，搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶于4℃保存，使用时可向mL培养液中加入2uL为1mmol/mL的高糖母液，即配成浓度为22mmol/L的葡萄糖溶液。
（2）PI染液：
将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为50ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。
2、方法
（1）细胞的培养
细胞培养于含10%胎牛血清的完全培养基中，置于37℃，5%CO2，饱和湿度条件的培养箱内，根据细胞生长速度，0.25%胰酶消化传代培养。
（2）细胞总RNA的提取和cDNA的制备
①RNA的提取：备冰，取一瓶对数生长期的细胞，吸去上清，2mLPBS洗涤2次后加入1mLTRizol液，反复吹打以裂解细胞，室温放置5min，将裂解后的混合物转移到1.5mL无RNA酶EP管内，每管加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s混匀，室温放置5min；10rpm，4℃，离心15min；小心吸取上清无色水相μL入另一只1.5mL无RNA酶EP管内，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min；在4℃，10rpm，离心10min，此时有RNA沉淀产生，弃上清；加入4℃预冷的75%乙醇1.0mL洗涤沉淀，4℃，7rpm，离心5min；去上清，再点离心，去尽残留的乙醇，沉淀物自然干燥10-15min；在RNA沉淀物中加入DEPC处理水20-30μL，中枪打匀，测OD值，-70℃保存备用。全过程使用无RNA酶枪头操作。
②cDNA的制备：按RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit说明书，
先加入1μLOligo（dt），3μgRNA，8μLDEPCtreatedwater混匀，65℃放置5min，再置冰上5min；加入4μL5×Reactionbuffer，1μLRibolockTMRNaseInhibitor，2μL10mMdNTPMix，1μLRevertAidTMM-MulReverse共20μL反应体系。42℃60min，70℃5min终止反应，即获得cDNA，-20℃保存备用。
（3）基因片段的克隆
根据基因序列以及质粒的多克隆位点，设计合成引物，以cDNA为模板，用高保真Primerstar酶，通过PCR方法扩增基因序列（即完整开放阅读框含终止子的基因片段，同时在扩增片段两端引入限制性内切酶HindⅢ及BamHI酶切位点）。引物公司合成。
将PCR产物进行柱纯化。纯化产物进行双酶切反应，酶切反应条件为：15μL纯化产物，5μL10×bufferBamHI，1.5μLBamHI，2.5μLHindⅢ，加ddH2O22μL至45μL，37℃3h;载体质粒采用酶切反应条件为：1μL质粒，3μL10×bufferBamHI，0.5μLBamHI，1μLHindⅢ，加ddH2O24.5μL至30μL，37℃3h。
酶切完成后的PCR产物和载体质粒均用DNA纯化试剂盒纯化，测OD值计算其含量。然后将目的DNA片段与载体质粒进行连接。连接产物进行转化，挑取克隆并经HindⅢ和BamHI双酶切鉴定。序列片段经测序确认。
（4）表达质粒转染细胞
将细胞按1×/ml密度接种于50CM2培养瓶中，用含10%胎牛血清的培养基在37℃,5%C02及饱和湿度的培养箱中培养至对数生长期。转染前配制DNA-脂质体复合物如下：①取质粒10.0ug混合于无双抗的优化培养基中，终体积为uL；②将6ulLipofectamineTM0加入另一管无双抗的优化培养基中轻混匀后静止5min，终体积为uL；③将①和②混匀，室温静置25min后即形成DNA-脂质体复合物。在DNA-脂质体复合物加入培养瓶前5min，将培养瓶中的目的细胞用PBS清洗2遍，换上新鲜的含10%血清的培养基2.6mL，置于37℃,5%C02的细胞培养箱中培养24h。
（5）高糖处理
细胞转染24h后，倒去培养液，用PBS液清洗2遍，换上含10%胎牛血清和不同浓度葡萄糖的培养液后放入细胞培养箱中继续培养24h。实验分为2组，即葡萄糖5.5mmol/L组及葡萄糖22mmol/L组。
（6）流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡
以上各组细胞培养24h后，弃去培养液，PBS清洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞间出现间隙即中止消化，加入3mL培养基后吹打成单个悬浮细胞。将细胞悬液转移入10mL离心管，rpm，离心7min，去上清；加入1mLPBS洗涤细胞，rpm，离心7min，去上清；将细胞沉淀用预冷的PBS定容至uL，振荡均匀，后将其慢慢加入至uL预冷的无水乙醇（70%乙醇）中固定，4℃，过夜。70%固定的细胞悬液，离心，弃去乙醇，PBS洗两遍；加入RNA酶工作液（终浓度25ug/ml)37℃，30分钟；加入PI（终浓度50ug/ml）冷暗处30分钟；过目尼龙网，流式细胞仪检测。PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为nm，发射光波波长大于nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。通过操作软件SYSTEMII计算细胞周期各时相的百分率。
结果判断：在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一DNA低染细胞群，即亚二倍体峰（Sub-G1）或称Ao细胞群，也就是凋亡细胞群。
四、RT-PCR检测细胞mRNA表达
1、引物设计与合成
用于扩增细胞中目的基因、内参GAPDH的引物序列通过Primer5软件设计，由公司合成。
2、细胞总RNA的提取
按照Trizol试剂盒说明书步骤进行：
①从培养箱中取出单层平铺的细胞培养板，迅速吸去培养液，用PBS溶液洗2~3次，用滤纸吸净残余的液体，每孔加入1mlTrizol裂解细胞，冰上放置10min。
②轻轻吹打细胞，观察液体变粘稠，细胞脱壁，收集裂解液至经DEPC处理过的1.5mlEP管中，每1ml的Trizol试剂提取的样品中加入新开的氯仿0.2ml，震荡混匀15s，冰上静置10min后放入离心机，10rpm、4℃离心15min，取上清无色水相（约0.6ml）到另一DEPC处理过的EP管中。
③加入新开的异丙醇0.5ml，颠倒混匀后冰上静置10min,10rpm、4℃离心10min，弃去上清，保留管底的黄白色沉淀。
④加入75%DEPC乙醇（无水乙醇：DEPC=3:1）1ml充分洗涤后，7rpm、4℃离心5min，去上清。室温干燥RNA沉淀5~10min，用DEPC水20μl溶解后分装，存于-70℃。
⑤取5μlRNA溶液按照1：稀释至μl的TE（10mmol/L，Tris-HCLpH8.0，1mmol/LEDTA）中，使用紫外分光光度计测定OD/OD，比值在1.8～2.0之间为最佳浓度。
⑥1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA抽提结果。紫外光下观察提取的RNA质量，可见25S、18S、5S三条带。
3、逆转录反应
按照逆转录试剂盒合成cDNA。
①将无酶的EP管置于冰上，依次加入TotalRNA2μl、Oligo(dT)18primer(0.5μg/μl)1μl和DEPC水9μl，混匀后在70℃孵育5min，冰上冷却。
②将无酶的EP管置于冰上，继续加入5×reactionbuffer4μl、RiboLockTMRNaseInhibitor(20u/μl)1μl和10mMdNTP2μl，混匀后在37℃孵育5min。
③再加入RevertAidTMM-MuLV逆转录酶（u/μl）1μl，反应体系总体积为20μl，在42℃反应60min，加热至70℃孵育10min终止反应，冰上冷却，反应产物-20℃保存备用。
4、聚合酶链反应
将EP管置于冰上，依次加入cDNA1μl、上下游引物各0.5μl、2×MasterMix10μl、ddH2O8μl，总反应体积为20μl，振荡混匀。选用GAPDH为内参。
一般扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，56.5℃退火30s（退后温度需进行梯度选择），72℃延伸1min，共32个循环（此循环数仅供参考）；末次循环72℃延伸10min，4℃保存。
GAPDH扩增条件：94℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共26个循环（此循环数仅供参考）；末次循环72℃延伸5min，4℃保存。
5、扩增产物分析
称取0.75g琼脂糖移入三角瓶中，再加入50mlTBE电泳缓冲液，混匀，微波炉加热至沸腾即可，冷却到70~80℃时，加入2.5μlEB，轻轻摇匀，倒入凝胶模具内，插好梳子，吸出气泡，室温下自然冷却。RT-PCR产物8μl、GAPDH2μl加入上样孔中；为确定PCR产物分子量大小，用DNA分子量参照物PUXMixMarker同时电泳，加样量2μl，V电泳40min。电泳后将凝胶置于UVP凝胶图像分析系统中检测，根据DNAMarker判断产物。应用AlphaImager2软件进行灰度扫描，测定各条带的积分光密度值（OD），以光密度代表其表达量。
目的基因相对表达量=目的基因密度/GAPDH基因密度×％。
五、WesternBlot测定细胞蛋白表达
1、①细胞蛋白提取
从培养箱中取出单层平铺的细胞培养板，吸去培养液，用PBS洗涤3次后，用滤纸吸净残余的液体，加入蛋白裂解液μl（三去污裂解液：PMSF=94：6），置于冰上15min，使细胞充分裂解后，用细胞刮棒将细胞刮落，收集细胞于EP管中，放入离心机，0rpm，4℃，离心10min，将上清液吸出转移至新的EP管中，吸取少量进行BCA蛋白定量，余下的加入蛋白上样缓冲液（上清液：蛋白上样缓冲液=4:1），混匀后，沸水中煮8~10min，取出冰上冷却，-20℃保存。
②样品制备：取待测组织，用PBS洗涤3次，洗去残血，加入组织裂解缓冲液，冰浴条件下剪碎组织，玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解，于4℃，0g离心10min，小心吸出上清液，根据BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明书进行蛋白定量，取50μg蛋白加入2×SDS凝胶加样缓冲液中，在°C加热5min使蛋白变性。
2、SDS-PAGE凝胶电泳
将两块洗净的玻璃板对齐后放入夹中卡紧，垂直卡在槽中。将10%分离胶沿玻板灌入，待胶面升至约梳齿下1cm时即可，然后在分离胶液面上加入去离子水液封促进凝胶。室温下静置30min左右，当水胶间出现折射线时，倒掉上层的去离子水，用滤纸吸干残留的水分，用5%的积层胶灌满玻板剩余空间。将梳子水平插入积层胶中，室温下静置30min左右，待积层胶凝固后拔出梳子。将做好的胶放入电泳槽中，加入电泳液，将待测的蛋白等量加入胶孔中。电压80V，电泳约30min，待蛋白跑入分离胶后，将电压改为V，电泳约90min，待溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳。
3、转膜
将电泳后的凝胶从玻板中取出，切除积层胶以及分子量以外的分离胶。裁好合适尺寸的PVDF膜，将膜放入甲醇溶液中浸泡3~5min活化，并在膜的一角做好标记。准备6张滤纸和2张海绵，放入转移缓冲液中浸泡，将夹子打开，按海绵——三层滤纸——分离胶——PVDF膜——三层滤纸——海绵的顺序依次叠加后，合上夹子。将夹子放入转移槽中，膜在正极一侧，胶在负极一侧，然后加满转移缓冲液，-V稳压转膜min。
4、封闭及孵育抗体
转膜结束后，用丽春红染液对PVDF膜染色数秒，观察转膜效果。迅速用去离子水洗脱，用5%的脱脂牛奶进行封闭，室温摇床温育3~4h或4℃过夜。之后将PVDF膜放入装有稀释好的目的一抗（1：）的封闭袋中，排除气泡，室温下摇床温育3~4h或4℃过夜。弃一抗溶液，用TBST液洗膜3次，15min/次。在将膜放入含二抗（1：0）的封闭袋中，排除气泡，室温下摇床温育1.5~2h。弃二抗溶液，用TBST液洗膜3次，15min/次。
5、显影
暗室中将A和B两种发光液按1:1比例混合，沥尽PVDF膜表面液体，将膜蛋白面朝上，滴加A、B混合液反应1~2min后，进行X光压片，曝光后迅速浸入显影液显影，待出现明显条带后，马上放入定影液中至胶底片透明为止，清水冲净晾干。
6、结果判断
用AlphaImager2软件对印迹区进行灰度扫描，以β-actin为内参照，将各组面积灰度值与β-actin灰度值的比值进行比较，统计数据进行分析。
主要试剂：
DMEM/LOWGLUCOSE培养基
胎牛血清
胰酶
BCA蛋白定量试剂盒
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒
目的一抗
β-actin一抗
目的二抗
PVDF膜
ECL发光试剂盒
X-OMATBT胶片5×7英寸
MTT试剂盒
Westernblot相关试剂配制：
（1）1MTris-Hcl（PH8.8）ml:称取12.11gTris碱，加入50mlddH20，缓慢加入浓盐酸至PH8.8（约2.1ml），冷却至室温定容至ml。第二天高压灭菌。4℃保存备用。
（2）1MTris-Hcl（PH6.8）ml:称取12.11gTris碱，加入50mlddH20，缓慢加入浓硫酸至PH6.8（约8ml），冷却至室温时定容至ml。第二天高压灭菌。4℃保存备用。
（3）10%SDSml:10gSDS溶于90mlddH20中，加热至68°C助溶，加入浓Hcl调PH至7.2，定容至ml。
（4）30%Acr-Bis（Acrylamide：N-MethyleneBisacrylamide）:Acr：Bis=29g：1g，ddH20定容至ml。锡箔纸避光4℃保存备用。
（5）10%APS(过磷酸铵):10gAPS+mlddH20=0.1gAPS+1mlddH20，避光4℃保存备用。最好现配现用。
（6）TEMED:分装，4度避光保存。
（7）1MTris-Hcl（PH7.6）ml:称取12.11gTris-base，加入50mlddH20，缓慢加入浓Hcl至PH7.6(约6ml)，冷却室温定容至ml。
（8）TBS(PH7.6)ml:（20mMTris-Hcl，mMNacl）1MTris-Hcl（PH7.6）20ml+Nacl8.8g，加ddH20定容至ml。
（9）TBST:1LTBS+1mlTween-20，其终浓度为0.1%。
（10）10×Tris-glycin电泳缓冲液ml:30.2gTris，gglycin，10gSDS加蒸馏水至ml定容（SDS在定容后再加入，避免因产生气泡而影响最终容积），可以在过程中加热助溶。用时用双蒸水稀释成1×。
（11）10×Tris转膜液ml:Tris-base30.3g，glycing，蒸馏水定容至ml，使用时配成1X转膜液1L，即10X转膜液ml+甲醇ml+蒸馏水ml定容至1L，4度预冷备用。
（12）ECL发光液:mMTris（PH8.5）10ml+mMLuminol50μl+P-Counaricacid22μl+30%Hydrogenperoxide（H2O2）2.75μlmMTris：1.21g溶于mlddH20mMLuminol：4.43g溶于mlDMSOP-Counaricacid：14.g溶于mlDMSO30%H2O2：避光保存于4℃。
六、ELISA的基本步骤
双抗夹心ELISA的方法检测血清*的水平。
检测前将试剂提前20分钟从冰箱中取出，平衡至室温已供使用。具体检测步骤如下：
（1）用包被缓冲液将一抗稀释至2mg/ml，在每个酶标板的反应孔中加ul，4℃过夜。次日，弃去孔内的液体，用含0.05%吐温20的TBS（TBST）洗3次，每次1分钟。
（2）封闭:每孔中加入ul封闭液（TBS-caseinblockingbuffer，Pierce），室温1小时。
（3）准备血样和标准品：将血清样本1:30稀释于分析液（50mMHEPES,pH7.4,mMNaCl,1%TritonX-,5mMEDTA,5mMEGTA），用1%BSA的分析液稀释标准品至浓度为ng/ml然后依次倍比稀释至终浓度0.24ng/ml（标准品配制中的1~7号）。
（4）加样：封闭结束后，TBST洗板3次，拍干后，加待检样本和一定稀释浓度的标准品ul于上述已包被的反应孔中，并作复孔，置于微量振荡器，室温下孵育1.5小时。
（5）加酶标抗体：1.5小时后，TBST洗板6次，用含0.1%BSA的分析液稀释HRP标记的抗体至浓度为1.0mg/ml，每孔中加入ul，室温1小时。
（6）加底物显色液：上一步反应结束后，弃去孔内液体，TBST洗板6次，于各反应孔中加入TMB底物溶液（Pierce）ul，室温下避光显色10-30min，此时肉眼可见标准品的各孔呈现有明显的梯度蓝色，即可终止。
（7）终止反应：依序每孔加入ul终止液2/3mmol磷酸，轻轻混匀30秒，终止反应，此时蓝色转为黄色。
（8）结果判定：反应终止后立即置于酶标仪（CliniBio）上于nm波长处检测各孔的光密度值（OD）值。根据标准品OD值绘制标准曲线，然后计算出血样本的值。
七、石蜡切片制作及HE染色
1.石蜡切片制作
将10%中性缓冲福尔马林固定的标本经蒸馏水冲洗0.5～1h→70%酒精浸泡24h→80%酒精浸泡24h→95%酒精I浸泡30min→95%酒精II浸泡30min→%酒精I浸泡30min→%酒精II浸泡30min→%酒精与二甲苯混合液（1:1）浸泡20min→二甲苯I浸泡20min→二甲苯II浸泡20min→软蜡浸泡10min→硬蜡浸泡10min→包埋制成石蜡块→连续切片（厚度为5μm）→摊片→60℃烤片1h→石蜡切片室温保存备用。
2.HE染色
将石蜡切片常规脱蜡和水化后，置于苏木素液中2-3min，1%的盐酸分化3sec,然后清水冲洗5min，入伊红中1min，再依次用95%和%酒精脱水各10min，二甲苯透明，中性树胶封片，制成HE染色切片。在光镜下观察。
八、骨髓间充质干细胞条件培养基诱导分化实验
1、骨髓间充质干细胞成骨分化及特异性染色
条件培养基：抗坏血酸0.1mM
地塞米松10μM
β-磷酸甘油10mM
α-MEM(含20%胎牛血清)
37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，隔天换新鲜条件培养液，培养三周
a)弃上清，PBS洗3次，每次5min
b)置4％多聚甲醛固定10min
c)PBS洗3次，每次5min
d)10mg/ml茜素红染色30min
e)去染液，蒸馏水洗3次
f)倒置显微镜观察，照相
2、骨髓间充质干细胞脂肪分化
条件培养基：地塞米松1μM
吲哚美辛60μM
胰岛素0.1μg/ml
IBMXμg/ml
氢化可的松0.35Mm
α-MEM(含20%胎牛血清)
37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，隔天换新鲜条件培养液，培养2周
a)弃上清，PBS洗3次，每次5min
b)置4％多聚甲醛固定10min
c)70～80%异丙醇或酒精稍洗或用蒸馏水稍洗
d)新鲜配制的5mg/ml油红O染色30min
e)去染液，70％乙醇浸洗2nim,蒸馏水洗2次
f)用苏木素淡染细胞核,充分水洗
g)倒置显微镜观察，照相
3、骨髓间充质干细胞软骨分化
条件培养基：重组人TGF-βng/ml
α-MEM(含20%胎牛血清)
a)取对数生长期骨髓间充质干细胞，0.25%胰蛋白酶（含EDTA）消化单细胞悬液，rpm，5min离心，弃上清
b)将细胞转入1.5mlEP管中，1mlPBS吹洗，1,rpm，5min，弃上清
c)细胞沉在1.5mlEP管底，缓慢加入条件培养基，切勿将细胞团打散
d)条件培养基常规培养4周,隔天小心换新鲜条件培养液，培养4周
e)离心弃上清
f)细胞团置4％多聚甲醛固定10min
g)弃固定液，OCT包埋剂包埋
h)Leica冰冻切片机制作快速冰冻切片
i)室温复温，0.1mmol/L醋酸钠-盐酸缓冲液（PH=1.0）洗片
j)1%阿辛蓝染色30min
k)0.1mmol/L醋酸钠-盐酸缓冲液（PH=1.0）洗3次，每次3分钟
l)1%核固红水溶液染核10min
m)0.1mmol/L醋酸钠-盐酸缓冲液（PH=1.0）洗3次，每次3分钟
n)常规脱水透明，中型树胶封片
o)显微镜观察，照相
启研网--刘艳赞赏
