血脂异常是心脑血管疾病发病的重要危险因素，高胆固醇血症与动脉粥样硬化血栓形成性脑梗死具有明显相关性。新型降胆固醇药物前蛋白转换酶枯草溶菌素/蛋白酶9（ProproteinConvertaseSubtilisin-like/KexinType9，PCSK9）作为血脂治疗的新靶标，是大血管动脉粥样硬化（large-vesselatherosclerosis，LVA）的重要预测因子，LVA脑卒中型发生的风险与PCSK9突变有相关性。既往对PCSK9对LVA型脑缺血的研究多采用PCSK9基因敲除小鼠，但是小鼠定制的昂贵价格是制约了应用。PCSK9质粒慢病毒（PCSK9shRNA）的制备，可实现PCSK9的基因沉默。靶向干扰PCSK9表达是控制脂代谢异常的有效策略之一，定向颅内注射PCSK9-shRNA的实验方法为LVA-MCAO的防治策略提供药理方法学参考。
实验方法
PCSK9shRNA颅内注射转染
1慢病毒制备过程：使用Ta工具细胞产生慢病毒的优化步骤。每个加入eGFP或mCherry阳性对照组的10cm培养板的慢病毒产量为10ml上清液（未离心），每毫升具有1-10×感染单位。经培养包装细胞、制备DNA/EndoRectin慢病毒混合物、转染包装细胞、收获慢病毒及滴度检验、经H细胞系以或药筛测定慢病毒滴度。
2有效序列筛选：取正常饲料喂养C57BL/6小鼠1只、高脂饲料喂养小鼠1只，质粒阴性对照、质粒慢病毒4个序列各2只，经尾静脉注射10μL，分别于注射后24h、48h取肾脏组织（肾脏为确定的PCSK9mRNA表达较强的部位），经Real-TimePCR测定筛选PCSK9沉默效果最佳的序列，用于颅内注射干预观察。
3颅内注射转染：LVA-MCAO术后即刻，将麻醉小鼠俯卧位，剔除头颅部位鼠毛，立体定位仪定位在小鼠右侧颅骨，前囟门后开1.2mm，右开1.2mm，进针深度3mm。选取筛选出的PCSK9shRNA最佳序列，用微量注射器吸取10μl注射。注射完毕后用明胶海绵止血，缝合皮肤。
PCSK9shRNA颅内注射转染效果观察
1PCSK9shRNA有效序列筛选经高脂饲料喂养后，小鼠肾组织内PCSK9mRNA表达明显升高，PCSK9shRNA阴性对照组较四个沉默序列PCSK9mRNA表达均高，四个序列中，以MSH-33-LVRH1GP(OS)PCSK9mRNA表达最弱，因此，筛选出该序列作为干预序列使用。数据见表1。
2PCSK9shRNA颅内注射对LVA-MCAO小鼠PCSK9沉默效果
WesternBlot测定结果表明，与假手术组比较，LVA-MCAO模型小鼠缺血海马区PCSK9蛋白电泳条带明显增强，sh-PCSK9转染后则明显减弱。免疫组化测定结果可见，LVA-MCAO模型小鼠缺血侧海马区PCSK9深染，表达明显增强，sh-PCSK9转染后，PCSK9着色降低。说明sh-PCSK9颅内注射法可沉默LVA-MCAO小鼠缺血海马区PCSK9的表达。数据见图1。
图1LVA-MCAO小鼠PCSK9蛋白表达条带及分布图（×）
A：高脂饲料+假手术对照组；B：LVA-MCAO对照组；C：LVA-MCAO-shPCSK9组
主编：冯文茹
供稿：王蕾
运营：潘宏健
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