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引言
动物细胞培养开始于本世纪初,发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法,利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等,已成为医药生物高技术产业的重要部分。
由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求,动物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求,迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前,世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。
细胞培养定义：
细胞培养是将活体组织或细胞从试验动物体内取出，放在模拟体内生存环境的体外环境（无菌、适温、营养丰富）中，使高体细胞生长、发育的一种方法。按照培养的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。根据细胞是否在支持物上生长，将其分为贴壁型和悬浮型。一般来说，圆形细胞如淋巴细胞属于悬浮型，而胞体梭型（成纤维型细胞）、扁平不规则（上皮型细胞）等属于贴壁型，贴壁型细胞必需贴附在支持物表面生长。
细胞培养目前主要应用于：
1、在病毒学中的应用
2、在肿瘤学中的应用
3、在药理学中的应用
4、在动物生产中的应用
5、在其他方面的应用
本节引自：占今舜的《细胞培养技术的应用研究进展》
1细胞培养环境
细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。
1、体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一。氨来源于两方面:一是直接来源于培养基,一是细胞代谢所产生。但两者都涉及谷氨酰胺,因此需要防止培养基中Gln自然分解,限制Gln用量,并尽量去除培养基中的氨。
2、乳酸是细胞糖代谢的产物：其中比较有效果的措施是降低培养基中葡萄糖浓度以减少乳酸产生的同时,必须平衡葡萄糖和Gln的比例。这些代谢改变机理的研究将有利于设计适当的控制方案。
3、随着细胞培养规模和培养密度的增大,二氧化碳的产生速率比通过换气从培养基中去除二氧化碳快因而导致CO2积聚,从而对细胞产生毒性作用或者改变细胞代谢水平。所以控制通气参数,平衡氧的输送及CO2的去除,防止生物反应器运转中CO2积聚仍是明智选择。
4、甲基乙二醛(MG)主要是丙糖磷酸去除磷酸基
后的代谢产物,也是脂类、氨基酸代谢的产物,对于细胞有潜在的损伤作用。通过批次培养中限制葡萄糖用量来降低葡萄糖消耗,由此来确定降低糖酵解代谢是否导致细胞内MG浓度降低,从而最终确定MG浓度降低。
5、渗透压对细胞的生长抑制作用。高渗透压不仅影响细胞批次培养中产量,而且影响细胞生长速度、对数生长期的长短、细胞死亡的速度等。可以用NaCl、KCl还是蔗糖浓度调节渗透压。
6、机械搅拌与喷气损伤。目前用多孔微载体替代了容易使细胞受机械搅拌与喷气损伤的常规载体。
2 细胞死亡与凋亡
大规模细胞培养的后期,维持细胞高的活力是个富有挑战性的课题。最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死,而人们逐渐认识到至少是一些细胞系在生物反应器中细胞死亡主要原因是细胞凋亡。随着细胞凋亡分子机制研究的不断深入,细胞凋亡的发生被认为是大规模细胞培养过程的重要制约环节,预防并控制细胞凋亡也因此成为研究热点。用基因工程方法将bcl-2基因这种细胞凋亡抑制基因导入细胞,成为众多研究者的选择。
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3培养基与细胞系
动物细胞培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素。在经历了天然培养基、合成培养后,无血清培养基成为当今细胞培养领域研究的一大课题。无血清培养基的优势在于避免了血清的批次、质量、成分等对细胞培养造成的污染、毒性作用和不利于产品纯化等不良影响。
最近研究表明,先使野生型宿主CHO细胞适应无血清培养基培养,然后转染这些细胞得到的重组克隆在基因扩增后保持了在无血清培养基悬浮培养中的生长能力,其产品在生化和结构上类似于未处理的宿主细胞产物。
4过程监控
大规模动物细胞培养中由于大量细胞的代谢,细胞培养环境迅速改变,在线过程监控更为重要。在生物反应器中,温度、pH值、溶解氧浓度是细胞培养规模放大的早期研究内容。现在,这三个参数对细胞的影响已经明确,并在培养过程中实行了有效控制。
测量在线氧吸收速率确定从细胞生长期生产病毒到病毒感染期和细胞死亡后终止感染的转换时间;用在线葡萄糖分析仪的测定调整灌流速度;测定氧消耗估计营养供应率的代谢负荷和控制;测定氧吸收速率估测ATP的形成;测量在线氧化还原能力作为活细胞浓度的指标等等众多特定参数均得以测定并加以应用。用亲和层析与在线取样系统偶联进行在线蛋白质含量测定的方法已经完成。另外,用在线蛋白分解与反相色谱监测重组蛋白的糖基化以了解产品的一致性也成为一项有应用价值的技术。
1~4引自林福玉《大规模动物细胞培养的问题及对策》
5三维立体微环境
细胞生长离不开三维立体微环境中各种细胞因子、生长因子、细胞间及细胞与细胞外基质（extra－cellularmatrix，ECM)间相互粘附等多种信号的调节。体外细胞培养技术就是在体外维持细胞、组织及器官生存及生长的一种技术
细胞培养技术经过不断的改进，经历了由二维到三维，由静止三维培养到动力三维培养的过程。本节引自宋鸿《细胞培养技术的研究进展》
6微生物污染及处理方法
细胞培养污染是指培养环境中侵入了对细胞生存有害的成分和造成细胞变异的异物。生物污染一般包括：细菌、霉菌、支原体、病毒、黑蛟虫污染，还有细胞交叉污染。下面主要对黑蛟虫污染进行简述。
黑蛟虫是一种生物还是非生物，学术界还有争论。其污染特点为开始对细胞无影响，当数量达到一定程度时就会对细胞产生影响。受黑蛟虫污染的细胞液通常清亮无变化。污染主要来源于血清，倍显微镜下可见点状或片状游动小体。
黑蛟虫早期污染一般采用如下方法:用0.25%的胰酶消化，当有少量细胞变圆或脱壁时，用血清终止消化，轻轻用培养基或D-Hanks液清洗3遍(缓慢流过细胞表面)，不要吹打，然后吹散细胞，换培养瓶培养，隔天换液。2d后重复一次，以后每24～36h换1次液，1周后，黑点可基本消失。也可用麦诺霉素10mg/L处理，连续1周，但麦诺霉素对细胞有毒性。
本节引自吴文亮《细胞培养中污染的防控措施》
结尾
本文引用了多篇文献，对细胞培养进行了简述，由于篇幅有限，所以很多内容只能点到为止，如果大家觉得意犹未尽，可以留言讨论，或者阅读源论文。如果大家觉得本文内容好，就请转发，谢谢。
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