5.2生化环境的优化控制5.2.1温度所有细胞生长都要受到温度变化的影响，大多数细胞只能耐受很窄的热变化范围。多数哺乳动物细胞培养温度在(36.5±0.5)℃。偏离了这一温度范围，对细胞的生长情况将产生影响，温度过高，甚至会导致细胞的死亡。体外培养的细胞对低温的耐受力比对高温强。温度上升不超过37℃时，细胞代谢强度与温度成正比；细胞代谢随温度降低而缓慢，温度降到冰点以下时，细胞可因胞质结冰受损而死亡。大多动物细胞对温度的敏感性较高，低温细胞的比生长速率可能明显降低，但细胞凋亡的速率也在降低，因此，在不同的培养阶段其温度需求可能不同。在细胞快速增殖期，维持培养温度在较高水平如(36.5±0.5)℃，在细胞培养后期，细胞生长缓慢，相反细胞的活率在逐步下降，为了降低细胞死亡的速率，可以将细胞的培养温度降到（33-35）℃左右，降低细胞代谢的速率，从而延缓细胞死亡的速率，同时也能提高细胞的生产能力。在实际采用悬浮培养技术进行细胞培养的时候，反应器通过浸入培养液中的温度电极来适时监控培养液温度，并根据检测的温度通过温度控制系统使温度保持在目标值范围内，因此温度电极的精确度及温度系统的反应灵敏度将会影响控制的精度。此外，环境温度对设备温度控制也可能会有影响。GMP车间要求的温度范围在19～28℃，通常在此条件下反应器自动控制功能能够良好的控温。在非GMP车间，随外界环境（季节）的变化，室温也会发生变化，导致生物反应器的温度控制可能发生波动，尤其在高温环境中，对于没有冷却系统的反应器，可能会发生控温不准。5.2.2溶氧氧是细胞生存必不可少的条件之一。细胞培养物对氧的需求不一样，大部分细胞适合低氧环境。细胞主要利用的是溶解在细胞培养基中的氧，气体中的分子态氧溶解在水中称为溶解氧（DissolvedOxygen），简称溶氧（DO），是表征水溶液中氧浓度的参数。DO电极测定的不是溶解氧浓度，而是氧活度或者是氧分压，并且在含有溶质、特别是盐类的水溶液中，其绝对氧浓度比纯水低。反应器中的DO水平通常用空气饱和度（％）来表示。DO能在一定程度上反映细胞的生理代谢变化和对产物合成的影响。不同细胞甚至同一细胞在不同的培养阶段需求的氧气不同，一般大规模培养过程的DO浓度控制在20%～60%的空气饱和度。DO一般影响细胞的生长，对产物的生成无直接影响。在细胞生长初期DO控制在较低水平，细胞对数生长期，细胞需求较高的DO浓度，控制其在较高水平，在产物生成期，控制DO在适当水平，防止DO太高加快细胞消耗营养物质，代谢产物不断增加，影响细胞的存活率，降低产物的比生成速率；但是DO过低，细胞对氧的需求得不到满足，同样会降低产物的表达。在生物反应器中通常采用DO电极在线测定培养液中的DO，每次使用时通常需要用空气和氮气来标定%和零点。在实际培养过程中，当溶氧低于设定值时，控制阀启动，向生物反应器中通气提高DO至设定值。当溶氧高于设定值时，控制阀关闭，停止向反应器内通入含氧气体。如此循环来保证细胞生长所需的氧气在设定值范围内。从而保证细胞在正常的DO环境中生长。在反应器大规模培养细胞过程中，影响DO发生变化的因素较多，针对变动的原因，其主要的调节方法如下列所述：1)调节供气中的空气、氧气和氮气比例，通过生物反应器的自动控制功能更加精确的通入各种气体的比例；2)采用纯氧控制，在对数生长期，细胞的耗氧能力就特别强，可以通入纯的氧气以适应细胞生长的需求；3)增加搅拌转速，将生物反应器的转速和DO控制自动连接起来，DO的高低通过转速的大小自动来控制，DO较高时，转速自动调高，使DO逐步下降，DO降至目标点后，再逐步降低转速。当DO低于设定值时，自动通入氧气，如此循环使细胞能在稳定的环境中生长；4)通过改进反应器的设计，如改变气体的通入方式，由于通入的气体会产生泡沫，容易损伤细胞，因此目前生产中，有很多的通气方式及相应的改进措施。影响DO的因素较多，通气方式是其中的一种。如表层通气或是深层通气，采用表层通气时，对于大规模动物细胞培养不适合。研究显示，在2L的小搅拌式生物反应器中，采用微载体培养Vero细胞，使用表层通气组的细胞密度及增殖速度明显低于采用深层通气组；并且随着培养体积的增大，溶氧受搅拌速率、通气速率及表面积/体积比等的影响进一步扩大，并且在控制溶氧的过程中，通气量的大小对细胞也有较大的影响，避免气泡运动或是气泡的破裂对细胞的损伤，并且还可能造成病毒对细胞的敏感性变化。大规模生产腺病毒载体的一个挑战就是鼓泡通气过程中造成的病毒对细胞的敏感性变化问题。实验结果显示，在无血清条件下，鼓泡通气方式与其他方式如表面通气方式，能够明显降低腺病毒的敏感性。进一步的研究发现，如果毒株液中含有少量的表面活性剂（聚山梨醇80，PS-80），含量仅0.%(v/v)，对病毒就会产生较大的影响。为了降低该种效应，对种毒培养液进行优化，去除PS-80，同时，增加无血清培养基中的Pluronic-F68浓度至1g/L，细胞的生长和代谢没有变化，通过这两种方式病毒损失率完全消除，并且该种方式可成功放大到L，通气条件模仿00L培养条件。5.2.3pH值动物细胞适应的pH范围一般在6.8-7.3之间，低于6.8或高于7.3都可能会对细胞生长及产品等产生不利的影响。LONZA公司针对CHO细胞在pH值分别为7.0和7.3条件下进行培养，结果表明pH7.0时，细胞密度是pH7.3的近2倍，生产率是2.5倍。因此在培养过程中，合适的pH控制对于产品的产率具有较大的影响。生物反应器使用pH电极进行在位pH检测，由控制程序自动控制酸碱液的加入，实现pH精确控制。通常，pH控制与二氧化碳通气控制阀，以及酸、碱蠕动泵相关联，通过控制二氧化碳、酸液、碱液的开关，实现pH的自动控制。当pH低于设定值时，控制器启动碱液蠕动泵，补碱（7.5%-8%）的NaHCO3或12%Na2CO3或1mol/L的NaOH提高pH至设定值；当pH高于设定值时，控制器启动二氧化碳气体电磁阀或是酸液蠕动泵，降低pH至设定值。一般细胞培养基的pH越高，细胞产生的乳酸就越多。所以较低的pH有利于减少细胞产生的废弃物，延缓细胞的死亡。原因可能是胞内pH对细胞代谢有很大的影响。胞内pH下降0.2个单位，可以使磷酸果糖激酶失活，抑制糖酵解途径，使细胞的生长受阻。而胞内pH上升0.2个单位，可以提高糖酵解速度50%。在细胞培养过程中葡萄糖代谢的副产物乳酸的产生，以及细胞代谢呼出的CO2逐渐积累于培养液中，会使得pH值不断下降。因此在反应器培养细胞的后期过程中也可以通过加大通气量或是相应的提高转速以减缓pH下降的速度。此外为了维持细胞生长所需的最适pH，可以提高初始细胞培养基的pH值，或者选择缓冲能力比较好的细胞培养基（可通过加入一定浓度的HEPES）。5.2.4CO2二氧化碳是一个影响细胞增殖和代谢的重要参数。研究显示，二氧化碳的积累，不但对蛋白质糖基化有影响，而且影响细胞的增殖及生产分泌能力。在细胞培养过程中，一般二氧化碳的量应该在40mmHg（二氧化碳分压）左右。但是在大型生物反应器中，随着细胞密度的增加，二氧化碳的产生速率比通过气体交换从培养液中去除二氧化碳的速率快，导致积累的二氧化碳浓度较高，有时候可达到mmHg。二氧化碳的大量积累会导致pH下降，如果用碳酸氢钠控制pH值，碳酸氢钠也会带来乳酸，使二氧化碳浓度进一步升高导，细胞渗透压也相应升高，最终影响的细胞的生长以及导致产物的质量和产量的下降。Gray等对CHO细胞反应器大规模培养时发现，二氧化碳水平超过mmHg时，CHO细胞生长即会受到抑制，其产率也会明显下降。细胞培养液中的二氧化碳水平受罐体大小（主要是表面积/体积）、搅拌速率及通气方式（表层通气、深层通气）影响较大，其中搅拌速率和通气方式可以适当调整，如可以加大通气气泡的直径及通气速率等；此外，在大规模培养过程中，还通过控制流加培养过程中与呼吸作用相关的活性碳水化合物的浓度来降低二氧化碳的积累，如可以用碳酸钠代替碳酸氢钠来控制pH值；或在流加或是灌流培养时，将灌流培养用培养基pH调高。
细胞培养基及动物细胞悬浮培养技术二十五
发布时间:2017-8-6 16:40:11 点击数： 次
