人羊膜上皮细胞治疗脊髓损伤的临床前研究报告
一.研究背景
脊髓损伤（spinalcordinjury，SCI）可因各种因素引起，比如：外伤、炎症、肿瘤等，造成病人脊髓损害平面以下运动、感觉及内脏括约肌功能的永久性障碍，出现截瘫，使患者面临终生残疾。脊髓损伤目前并没有有效的治愈方法。干细胞治疗能修复和再生受损的神经细胞、促进神经功能的恢复和重建，是具有广阔应用前景的治疗手段，目前已经逐步进入临床研究。
人羊膜上皮细胞，是由受精卵发育至第8天的囊胚内细胞团分化而来。人羊膜上皮细胞具有以下生物学特点：（1）具有类似于胚胎干细胞（ESCs）的分化潜能特性，能表达OCT4和Nanong等ESCs的标志物，能分化成三胚层来源细胞，如神经细胞、肝细胞、内皮细胞和心肌细胞等；（2）具有神经细胞的某些特征，能表达神经元及神经胶质细胞的标记物，如Nestin、MAP2和GFAP；（3）可分泌多种神经营养因子，如BDNF，NT-3和NGF，有神经保护作用；（4）不表达HLA抗原，如HLA-A、B、C、DR蛋白、β2-微球蛋白，移植后不会引起明显免疫排斥；（5）表达HLA-G，具有免疫抑制活性，可以抑制淋巴细胞增殖和浸润；（6）端粒酶水平低，致瘤风险低；（7）羊膜作为分娩废弃物，来源广泛，可提供大量人羊膜上皮细胞无伦理问题。
鉴于人羊膜上皮细胞可以体外诱导分化成多巴胺能神经元、表达多种神经干细胞表面标记以及分泌多种神经营养因子。所以合作单位上海赛傲生物技术有限公司的首席科学家、中科院细胞生物研究所原所长郭礼和教授，最早提出羊膜上皮细胞对脊髓损伤具有治疗作用，并积极开展了相关临床前研究，包括细胞水平试验、小动物实验、大动物试验，取得了令人鼓舞的结果。相关研究结果如下。
二.相关研究报告
1.细胞水平试验：
（1）人羊膜上皮细胞可以在大鼠脑内存活两个月
（图1：GFP标记的人羊膜上皮细胞可以在大鼠脑内存活2个月）
（2）人羊膜上皮细胞可在大鼠脑内存活，并且向神经元分化
（图2：A：hAEC在大鼠大脑皮层内向四周迁移和分化，并形成神经网络状结构；B：hAEC在胼胝体内沿着神经纤维束向一侧方向迁移和分化，并分化成类似两极或多极的神经元；C：hAEC迁移至海马齿回，沿着沟回排成单层，并形成单极神经元样细胞；D：hAEC迁移到第三脑室，并嵌入室管壁形成一层柱状上皮样细胞。其中D1中绿色代表hAEC，D2中红色代表第三脑室中vimentin阳性的室管膜上皮细胞，D3重叠的黄色代表hAEC分化为室管膜细胞。）
（3）人羊膜上皮细胞可以在体外诱导分化成神经元样细胞，表达多种神经元细胞表面标记，分泌多种神经营养因子。
（图3：人羊膜上皮细胞表达神经干细胞、神经元和胶质细胞表面标记）
（图4：人羊膜上皮细胞分泌神经营养因子）
（图5：人羊膜上皮细胞可以合成和分泌多巴胺，表达多巴胺受体和转运体）
2.人羊膜上皮细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的试验
方法：作者将分离得到的人羊膜上皮细胞用Hoechst进行标记。大鼠分为假手术组、细胞移植组、PBS组。移植在损伤后立即进行，用1mm×2mm×3mm的明胶海绵沾取约含1×HEACs的PBS液（5微升）行原位移植，PBS组则用1mm×2mm×3mm的明胶海绵沾取5微升的PBS液行原位移植，假手术组不进行任何移植。作者通过BBB评分对大鼠的后肢运动功能的改善进行了评估；通过形态学检测分析了移植的细胞在大鼠体内的存活情况、损伤灶的修复情况以及移植灶处髓鞘纤维的生成情况。
结果发现：羊膜细胞移植到脊髓损伤灶后能够存活下来并与宿主整合，损伤灶被移植的细胞和增生的胶质细胞完全充填，没有囊肿和疤痕形成，髓鞘纤维的化学染色发现，移植界面中存在大量的有髓鞘纤维，而对照组稀少。
（图6：光镜下观察到的培养5天以后的人羊膜上皮细胞形态）
（图7：手术后3组大鼠的BBB评分，细胞移植组的评分明显高于PBS组）
（图8：在荧光显微镜下，Hoechst标记的人羊膜上皮细胞呈蓝色荧光，3A表示移植人羊膜上皮细胞2w后，可以在损伤处看到大量的人羊膜上皮细胞，明胶海绵（箭头所指）还没有被完全吸收，3B表示移植人羊膜上皮细胞8w以后，明胶海绵消失，人羊膜上皮细胞仍然存活；通过焦油紫染色，4A表示PBS组，损伤脊髓的损伤腔存在疤痕和囊肿，活化的胶质细胞稀少，4B表示在细胞移植组，羊膜上皮细胞整合到宿主脊髓，没有生成囊肿或者瘢痕，并且能观察到大量的被激活的胶质细胞，可以很明显的看出来，细胞移植组比PBS组有更多的胶质细胞；Pal-Weigert髓鞘纤维染色，有髓鞘的轴突呈黑色，其他组织未染色。5A表示在移植后8w时，PBS组脊髓少量有髓轴突（箭头）存在，5B表示在移植后8w时，细胞移植组有大量髓鞘的轴突（箭头）存在）
（图9：红核神经元移植8周以后，A表示假手术组，红核神经元呈卫星状，胞浆染色不均匀，轻度染色核内有一个黑暗的核仁；B表示细胞移植组，细胞大小与PBS组相比有部分恢复；C表示在PBS组，箭头指明了细胞体的萎缩。）
结论：将人羊膜上皮细胞移植到大鼠脊髓损伤处，细胞可以存活时间很长，不会引起免疫排斥。人羊膜上皮细胞促进了轴突的再生，改善了后肢运动功能，抑制了被切断的RN神经元的萎缩。
3.人羊膜上皮细胞移植治疗灵长类动物脊髓损伤的试验
方法：首先将移植的细胞用GFP进行标记，另外取一部分GFP标记的细胞用BDNF基因进行转染。动物模型选择成年恒河猴6只，其中对照组2只，人羊膜上皮细胞移植组2只，移植转染了BDNF的人羊膜上皮细胞组2只。麻醉用肌肉注射氯胺酮20mg/kg，手术时间延长时可追加注射剂量半量。取T10~11做椎板切除，硬脊膜切开，显微镜下半切断T10~11脊髓。治疗组以明胶海绵中吸附人羊膜上皮细胞或转染BDNF基因的羊膜上皮细胞，在脊髓半切后同时于损伤灶植入。对照组以明胶海绵吸附生理盐水植入损伤灶。
通过逆行追踪剂荧光金染色来对人羊膜上皮细胞进行示踪；通过形态学观察脊髓正常侧和切割侧染色变化，观察脊髓半切切口移植处乙酰胆碱酯酶(AChE)组织化学染色，酪氨酸羟化酶(TH)和胶原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学检查。通过行为学观察动物后肢运动恢复状况如行走、攀缘、支撑和协调运动等。
结果：（1）丽春红染色和焦油紫染色说明治疗组和对照组半切侧背索、外侧索及前索被完全切割；（2）治疗组AChE、TH和GFAP免疫染色：在移植处正常侧外侧索中有大量的AChE阳性和TH免疫阳性纤维，在移植侧的移植物内，特别是与宿主的交界面也有一些阳性纤维，与正常侧比虽数量少但其纤维较粗，特别是TH免疫阳性纤维。（3）宿主和移植物交界面内见GFAP免疫阳性细胞，移植物内见GFAP免疫阳性细胞。对照组AChE、TH和GFAP免疫染色：在移植处正常侧外侧索中有大量的AChE阳性和TH免疫阳性纤维，在移植侧的移植物内，特别是与宿主的交界面也有很少阳性纤维，与治疗组相比其纤维更细，且数量少，特别是TH免疫阳性纤维。宿主和移植物交界面内GFAP免疫阳性细胞与治疗组相比也较少，移植物内未见GFAP免疫阳性细胞。（4）荧光金染色：治疗组在切口下方损毁侧外侧索内有大量被FG标记的呈强荧光细胞。切口上方脊髓损毁侧也有一些标记，但比切口下方明显减少。在移植物内有FG标记。对照组移植物内未发现FG标记。移植物内未见羊膜上皮细胞。（5）行为学观察：对照组半切侧后肢无运动功能，痉挛性瘫痪，依靠前肢及对侧后肢可匍匐运动。人羊膜上皮细胞治疗组半切侧后肢可直立行走，但不能协调做攀缘支撑运动。人羊膜上皮细胞转染BDNF组，可直立行走，并能做攀缘支撑运动。
（图10：1表示造模T10~11脊髓半切染色，1a为丽春红染色，1b为焦油紫染色，显示模型组脊髓半切完全；2表示移植物AChE免疫染色，2a表示治疗组，箭头所示AChE较粗，2b为对照组，未见明显AChE纤维；3表示移植物TH免疫染色，3a为治疗组，箭头所示TH纤维较多且粗，3b为对照组，箭头所示TH纤维较少且纤细；4表示移植物GFAP免疫染色，4a为治疗组，箭头所示GFAP阳性神经胶质细胞，4b为对照组，未见GFAP阳性神经胶质细胞；5表示治疗组脊髓平切切口下方腹角FG标记的固有束神经元较多；6表示治疗组脊髓平切切口上方腹角FG标记的固有束神经元较少；7表示治疗组移植物内见FG染色）
结论：移植人羊膜上皮细胞使恒河猴脊髓半切损伤后运动功能明显改善。
经过细胞水平试验、大鼠试验、灵长类动物实验，充分证明了人羊膜上皮细胞对脊髓损伤具有修复和再生作用。
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