实验小站（一）
慢病毒系列
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慢病毒技术原理
慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA/miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。在研究RNAi方面，慢病毒技术是最为有效的一种解决方案。
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特点
1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞（比如神经元细胞、干细胞或其他原代细胞）。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂、操作简便。
5）可以根据需要制备多种标记。
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慢病毒包装简要流程
1）含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞T等。
3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、-80℃保存。
6）滴度测定目的基因鉴定。
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慢病毒的储存与稀释
病毒的储存
短时间内使用可将病毒暂时放置于4℃保存，如需长期保存需放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）
注意事项：A.病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒存储时间超过6个月，在使用前需要重新滴定病毒滴度。
B.反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%，因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，为避免反复冻融建议按照每次的使用量对病毒进行分装。
病毒的稀释
将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基（含血清或含双抗不影响病毒感染）混匀分装后4℃保存使用（请尽量在三天内用完）。
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慢病毒使用安全及使用规范
慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒因此没有毒性作用。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，WesternBiotechnology建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒。除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。
慢病毒操作必须在生物安全水平2的实验室内进行。任何时候穿戴防护衣，应用塑料移液管。固体废物须经℃，60分钟蒸汽消毒，液体废物经10%终浓度漂白剂处理后才能弃置。
使用规范
1）病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风机。
2）病毒操作时请穿戴实验服，戴口罩和手套。
3）操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液檫拭干净。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液或1%SDS中浸泡过夜后弃去。
4）用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板。用70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照，离开显微镜实验台之前，用70%乙醇清理显微镜实验台。
5）如需要离心，应使用密封性好的离心管，或者使用封口膜封口后离心，而且尽量使用组织培养室内的离心机。
6）脱掉手套后，用肥皂和水清洗双手。
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