随着miRNA领域研究越来越普遍，慢病毒包装实验也成为了实验室中最常规的实验之一，今天小编为大家总结了国内顶尖miRNA实验室的慢病毒包装实验方案，供各位参考。
一
实验流程
1PackagingSystem包装慢病毒
1转染所需细胞最好是在25代以内，细胞代数太高会降低转染效率。转染前一天铺板，第二天转染时细胞密度介于80～90%。不同大小规格铺板所需的细胞数如表1所示。
表1细胞培养装置转染前一天推荐接种细胞数量
细胞培养
每孔接种细胞数
培养液体积（推荐）
12孔板
2.0-4.0×
1-2ml(1ml)
6孔板
5.0-8.0×
2-4ml(2ml)
60mm培养皿
8.0-10.0×
5-8ml(5ml)
mm培养皿
4.0-5.0×
10-15ml(12ml)
2配制转染体系：
DNA的准备：
为得到较高的转染效果和较好的重复性，建议使用去内毒素的试剂盒来提取质粒。用分光光度计准确测定质粒浓度，OD/应该≥1.9。
参照表2所示体系配制对应转染体系。
表2不同细胞培养装置中转染试剂所需用量
注意：不要在室温下搁置太长时间，充分混匀每个管
3把A液添加到B液中，中速涡旋10秒。
4在室温下孵育DNA-FECT混合物10min，这时可形成纳米复合物。
5把混好的DNA-FECT溶液（第4步制备）加入到第1步准备好的细胞中，前后左右轻轻晃动培养皿，使其均匀。在37℃，5%CO2条件下培养。
66~8小时后，更换相应体积（根据培养皿）的新鲜培养液换，在37℃条件下在培养48h。（细胞产毒量在48h后可达到最高）注意：移弃的培养液包含了可感染的慢病毒。所有接触慢病毒的物品，最后均需要灭活处理再丢弃。
7吸取慢病毒悬液。在~rpm下离心10min。注意：悬浮液包含可感染的慢病毒。
8用新EP管分装病毒液，并进行滴度测定。病毒可用以直接感染细胞。也可在-80℃保存。
9如果细胞状态好，可以在第7步后，继续换培养液，24h后再收一次病毒液。（为第72h病毒）
注：转染方式可以使用其他转染试剂（如lipo，CaCl2法），转染操作过程参见其说明
10病毒浓缩纯化：可通过PEG或CsCl密度梯度离心法，纯化慢病毒。（病毒纯化技术方法小编后期将详尽归纳）
注：如果一般细胞实验，可以直接用病毒原液感染细胞。
2Lenti-Viruses滴度测定
1检测前一天，将A细胞铺板于48孔板中，3.0-8.0×10E4/孔。
2次日，准备6~8个无菌EP管并依次编号为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6，…在每个EP管中加uLDMEM培养液（含polybrene）。
3加30uL病毒原液于第一个EP管中，充分混匀，从中再取30uL加入下一管EP。依次进行梯度稀释。
4、去掉第一步准备的细胞的培养液，从每个管中取uL稀释病毒液加入对于孔，做好标记。
5继续培养72h后观察荧光。
6滴度计算方法：
VirusTiter=cellnumbers(ofEGFP)×dilutionfactor/volume(ml)=Titer/ml
例如：10-6孔有六个荧光，即VirusTiter=6×10E6/0.25(ml)=2.4×10E7/ml
注意：滴度计算应取最后两孔对应的计算滴度的平均值（最后一孔荧光数应10）；无EGFPmarker的病毒滴度检测可采用其他方法，如：荧光定量pcr，ELISA等。
3Lenti-Viruses感染靶细胞
1感染前12-18h，将靶细胞铺板于6-孔板上（含10%FBS的DMEM培养基培养），第二天感染前，不超过40%~50%的细胞融合。
2轻轻混合冻融的病毒液，不要涡旋。需要提醒的是每次的冻融都降低2-4倍的病毒效价。避免反复冻融。
3根据靶细胞的培养液的量调节病毒和聚凝胺（polybrene）的添加量。病毒感染过程中聚凝胺（polybrene）的最终浓度5~10μg/ml（根据不同细胞而不同，推荐使用5μg/ml）。
4在靶细胞中加入病毒悬液，感染8-24h。
5移除丢弃存留病毒的感染培养液，换成新鲜的生长培养液。注意：移弃的培养液包含可感染的慢病毒。所有接触慢病毒的物品，最后均需要灭活处理再丢弃。
6继续培养细胞24-48h，在靶细胞中积累基因产物。
7收集细胞进行分析，或者puromycine抗生素再进行筛选。
病毒液感染推荐用量
培养皿规格
一般推荐用量
细胞数量
6-wellplate
~uL
~5×
30mmdish
1mL
~1×
注：细胞数量跟不同细胞的形态大小有关；以上病毒使用量是按原液病毒滴度计算，实际使用时请按照病毒滴度来相应调整
抗生素的最佳浓度推荐：
来源：实验狗
本期编辑：Tony
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