作者：陈智梅，高民，刘桂瑞，王瑶，李正洪，李兆林
摘要：本试验以泌乳奶牛乳腺组织为原料，采用组织块培养技术，研究培养基内不同氨基酸模式对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响。结果表明，随着培养天数的增加，细胞数量逐渐增加，第10天各组细胞数量分别达到最高，乳腺上皮细胞生长曲线呈“S”形。不同氨基酸模式对乳腺细胞生长有显著影响，与氨基酸不平衡组相比，氨基酸平衡组、理想组更能促进细胞生长，各组间差异显著（P0.05）。
关键词：奶牛；乳腺上皮细胞；氨基酸模式；培养；生长
哺乳动物的乳房是一个相对独立的系统，乳腺上皮细胞的最终功能是产生乳汁，乳汁中的许多成分只有乳腺上皮细胞才能合成。前人已在细胞水平上研究了乳腺上皮细胞的增殖及分化的调控。培养乳腺上皮细胞旨在研究动物或人的乳腺生长、发育及泌乳的细胞分子生物学机理及调控。
本试验通过研究培养基内不同氨基酸模式对乳腺上皮细胞生长的影响，从乳腺的生理状态，来了解不同氨基酸模式对乳汁分泌的影响，从而为揭示不同氨基酸模式对乳蛋白的调控机理提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料和仪器
1.1.1试验材料：奶牛乳腺（内蒙古呼和浩特屠宰场）
1.1.2试验试剂：DMEM/F12培养液（不含待测的三种氨基酸）（Sigma）、蛋氨酸（Sigma）、赖氨酸（Sigma）、亮氨酸（Sigma）、D-Hanks液（天津灏洋生物有限公司）、青霉素钠（Sigma）、硫酸链霉素（Sigma）。
1.1.3主要试验仪器
二氧化碳恒温培养箱（Forma），超净工作台（DLCJ-2N），组织培养倒置显微镜（Olympuse，日本），高压灭菌器（BGSB-HIRAYAMA），数显鼓风干燥箱（GZX-MBE），纯水机（21QX-PAQunxian），细胞计数板、电子天平、常温低速离心机，60公分培养皿（Nuc）。
1.2试验方法
1.2.1培养液的准备
培养液按说明用灭菌三蒸水进行配制，然后经0.22μm和0.45μm孔径的滤膜过滤除菌，4℃保存。
1.2.2氨基酸平衡指数的计算
氨基酸平衡指数（AminoAcidBalanceIndex，AABI，卢德勋，）是评价小肠可吸收氨基酸平衡性的指标（甄玉国，）（表1）。
表1对小肠可吸收氨基酸平衡性的评估
式中：AAAi为小肠可吸收氨基酸中第i种氨基酸以Lys为参照的相对值；IAAi为理想模式中第i种氨基酸以Lys为参照的相对值。
1.2.3培养基的配置
以奶牛乳蛋白的氨基酸组成模式为基础，根据原培养基说明，结合卢德勋提出的氨基酸平衡指数，调整三种氨基酸（Met、Lys、Leu）比例，设计不同氨基酸平衡指数的6个试验组。试验设计如表2。
1.2.4组织块培养
表mLDMEM/F12培养基溶液的配制
1.2.4.1乳腺组织的来源
乳腺组织来自一头健康的荷斯坦泌乳牛。取1g左右的健康乳腺组织，迅速装入已加有D-Hanks液（含双抗）的50mL灭菌离心管中，放在冰盒中带回实验室。
1.2.4.2组织块培养及收集样品
（1）组织块培养
在超净工作台上用含链霉素（IU/mL）、青霉素（IU/mL）的D-Hanks液反复冲洗组织，洗净血污和乳汁，尽量除去结缔组织和脂肪组织，然后用眼科手术小剪刀将乳腺组织剪成约1立方厘米左右的小块备用。
在培养皿中，将组织块反复剪切成1立方毫米左右大小为止（呈糊状），之后用吸管吸取含双抗的DHanks液把手术剪上的组织小块冲下，并且补加3～4mLD-Hanks液后，去掉上清，余下的组织块即可用于培养。用牙科探针将剪碎的1立方毫米大小的组织小块均匀摆布于60平方厘米的培养皿，每组织小块间距约0.5cm为宜。
种植完成后，盖好培养皿盖，置37℃、5%CO2培养箱3h左右，使组织小块微干涸，将培养皿从培养箱取出，轻轻加入3~5mLDMEM/F12培养液，让培养液慢慢覆盖瓶底上的组织小块，静置培养箱（37°C，5%CO2）培养。
（2）收集样品及计数
每天收集细胞上清液和组织块。在血球计数板上计数。
1.3试验数据统计分析
采用SPSS11.5软件包中ANOVA过程进行方差分析，均值的多重比较采用Duncan法。
2结果与分析
2.1奶牛乳腺上皮细胞生长曲线
以细胞密度（×10的6次方个/mL）为纵坐标，培养时间（d）为横坐标，绘制细胞生长曲线。从图1可以看出，细胞在氨基酸不平衡组、平衡组及理想组培养基中的细胞生长曲线略不同，但总体走向为：细胞在前4d内生长缓慢；第5天至第8天细胞进入指数增生期；第9天至第10天进入平台期；随着培养天数的增加，细胞数量也逐渐增加，第10天各组分别达到最高，随后细胞数开始下降。细胞生长曲线呈“S”形，与细胞生长的生物学规律比较吻合。
2.2不同氨基酸模式对乳腺细胞生长的影响（表3）
表3不同氨基酸模式对乳腺上皮细胞生长的影响（细胞密度：×10的6次方个/mL）
注：同行肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同小写字母表示差异不显著（P0.05）。
从表3可以看出，Ⅰ~Ⅵ试验各组的氨基酸模式均有利于细胞生长，数量增长比氨基酸不平衡组（对照组）迅速，其中第Ⅰ组细胞长得最快，说明第Ⅰ组的氨基酸模式更适合细胞生长。
结果表明，培养基内不同氨基酸模式对乳腺细胞生长有显著影响，其中第Ⅰ组培养基里的氨基酸模式达到最理想状态，对数生长期为第5天~第8天，细胞密度由2.56×10的6次方个/mL增至9.29×10的6次方个/mL，第9天达到1.×10的7次方个/mL，第10天时细胞密度达到1.×个/mL，且第9天、第10天各组间差异均显著。说明第9天~第10天达到平台期。
3结论
本试验获得的细胞生长曲线呈“S”形，与细胞生长的生物学规律较吻合。培养细胞潜伏期为第0天~第4天，指数增生期从第5天~第8天，细胞密度由9.29×10的6次方个/mL增至1.×10的7次方个/mL，第10天时细胞密度达到1.×10的7次方个/mL。平台期是第9天~第10天，此时是一代细胞中细胞生命力最强的时期，因此，是进行各种试验的最佳阶段。
本试验研究发现，培养基内不同氨基酸模式对乳腺细胞生长有显著影响，各组间差异均显著（P0.05）。随着培养天数的增加，细胞数量逐渐增加，第10天各组分别达到最高，随后细胞数开始下降。与氨基酸不平衡组相比，氨基酸平衡组、理想组更能促进细胞生长。
责任编辑：小镖
我们在这里分享能收集到关于养牛的一切信息，若您的文章愿意跟大家分享，或者您有更好的建议，请发至Fenxiang
moreycow.北京治疗白癜风去哪二甲基亚砜密度