体外分离纯化小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞
小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（TypeⅡalveolarepithelialcells,AECⅡ）分布于肺泡的表面，其数量占肺细胞总数的16%，但它仅覆盖肺泡表面积的5%。常规分离纯化小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的步骤如下：
1.酶消化法分离小鼠AECⅡ：Balb/C小鼠经脱颈处死后完整取下肺组织，剪成1mm3大小，D-Hanks漂洗至上清清亮；移肺组织块入无菌青霉素小瓶，按0.5mL/只小鼠加入0.25%的分散酶（含0.01g/LDNaseΙ和5%胎牛血清），4℃过夜后37℃继续孵育2-4h，大部分组织块被消化为细胞悬液，补充适量5%胎牛血清的DMEM/F12培养基后吸管充分吹打使细胞脱落，不锈钢筛网过滤细胞悬液，4℃、r/min离心5min，收集细胞。含10%的DMEM/F12悬溶细胞并计数，锥虫蓝染色了解细胞活性。
2.小鼠AECⅡ的纯化和培养：将肺组织细胞悬液按3x有核细胞/mL接种入小鼠IgG包被平皿，37℃、5%CO2培养箱培养，置37℃、5%CO2培养箱内孵育2-2.5h；吸取未黏附的细胞，r/min离心4min，收集细胞。DMEM/F12完全培养基悬浮纯化的细胞，调节细胞浓度至1x个/mL，并按4x个/cm2密度接种于Ι型Collagen包被的平皿中；37℃、5%CO2培养箱内培养24h，换液去除未贴壁细胞，继续培养3-5d。光镜观察细胞生长状态和形态特征。
3.透射电镜观察：纯化细胞悬液，经离心沉淀后2.5%戊二醛固定，PBS漂洗，丙酮脱水，1%四氧锇酸后固定，常规包埋、切片、染色后透射电镜观察。
4.免疫荧光染色鉴定小鼠AECⅡ：分别用特异性标记物SP-C、CCSP鉴定小鼠AECⅡ、Clara细胞。取培养36-48h细胞爬片常规固定、封闭、洗涤；抗SP-C抗体（1:）、抗CCSP抗体（1:）37℃孵育1h后4℃过夜；PBS洗涤3次后分别用FITC、RBITC荧光标记的不同来源的二抗（1:）37℃孵育60min；PBS洗涤3次；1mg/LDAPI细胞核复染10min；缓冲甘油封固后激光共聚焦显微镜观察。同时，设无一抗孵育组作对照。
值得注意的是，酶消化结合免疫黏附纯化法分离、纯化小鼠AECⅡ较为常用。常用的酶有胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶、分散酶等。其中胰蛋白酶较为常用，但其对细胞损伤较大，弹性蛋白酶价格昂贵不易获得，而胶原酶对细胞损伤较小，且消化充分，但成纤维细胞较多，增加纯化难度。
赞赏
