5.2.2微载体放大工艺及关键技术细胞高密度培养重要的技术就是微载体的应用，大多数细胞都是贴壁依赖性细胞，微载体技术在一定程度上克服了转瓶培养的不足，兼具单层培养和悬浮培养的优势，均相培养，容易放大，环境条件(温度、pH和CO2等)容易测量与监控，重现性好；并且微载体的表面积／体积(s／v)大，细胞培养基利用率较高，单位体积培养液的细胞可达到更高密度；此外微载体培养系统占地面积和空间小，简化细胞收获过程，减少人力、物力的投入，提高生产效率，降低生产成本。微载体放大工艺较为复杂，工业化反应器间直接放大较难，主要涉及的关键控制技术主要有：微载体的选择及使用、细胞的消化控制技术、细胞接种、细胞计数及污染的预防等。为特定细胞选择合适的微载体是该技术的关键前提，细胞成功地在微载体上扩展的能力随细胞系和细胞培养基的不同而变化，应根据各种细胞特性选择最佳电荷密度的微载体或对微载体表面特性的改进，提高细胞贴壁率的同时增加细胞的移动性，并且不干涉代谢产物的合成和分泌，同时满足操作简便、系统稳定、经济合理、对细胞无毒性等要求。贴壁细胞微载体悬浮培养工艺放大是当前研究的热点和难点，目前主要有3种方式：第一，将从转瓶培养收获的细胞随同微载体接种至一定规模的生物反应器。这一方式能够满足百升级生物反应器的规模放大，一般用作贴壁细胞微载体培养的初级放大，放大方式比较简单。全自动转瓶培养系统的应用能够提高该种规模放大方式的效率和可靠性，但同样仍然存在转瓶操作麻烦、工作量大、细胞差异性较大及污染机会多等缺点。第二，从较小的生物反应器中收获生长于微载体表面的细胞，转入下一级较大规模的生物反应器。这一方式通常能够满足10倍体积的规模放大，是贴壁细胞在生物反应器中培养规模逐级放大的主要方式。该种方式与第一种相比，细胞均一性及稳定性较好，污染的机会及工作量小，但是存在消化控制等一些技术难点。第三，将在较小生物反应器培养的细胞随同微载体直接转入下一级较大规模的生物反应器，借助细胞在新旧微载体间的转移实现培养规模放大，即是通常所说的“球转球”技术。这一方式虽具操作简便及污染机会少的优点，但由于其存在放大效率较低、不同载体表面的细胞生长状态有所不同的缺点，在贴壁细胞培养规模放大中的实际应用较少。在工业用搅拌式生物反应器中，微载体培养放大工艺与全悬浮培养放大工艺相比，细胞在载体上生长受到一定限制，放大规模难度大于全悬浮培养，但也取得了快速发展。从年VanWezel开发了微载体并实现在生物反应器中大规模培养贴壁细胞开始，20世纪80年代巴斯德研究所已开始利用L的生物反应器微载体培养Vero细胞生产人用狂犬病疫苗和脊髓灰质炎疫苗，发展到现在，Baxter在搅拌式生物反应器中利用微载体培养Vero细胞生产流感疫苗，8周内就可从1ml放大到L的规模，并且在年获得生产文号利用大规模微载体培养Vero细胞生产流感疫苗。M.Tanner博士（WerthensteinChemieAG,Switzerland）在第一次微载体交流会（罗马，）上介绍了一个在Cytodex3微载体上培养细胞大规模生产rAdV的过程。放大是从一个T-75方瓶培养开始，经过一个T-方瓶，3个T-方瓶，一个CF-10（10层的细胞工厂），4个CF-10，4个CF-40，12个CF-40和一个L生物反应器逐级放大到L生产规模的反应器。放大过程中避免污染，采用蠕动泵用于传送过程。使用微载体浓度为2~4g/L，接种量为8~20个细胞/微载体，控制反应器运行条件：pH7.2~7.4，溶氧DO约为40％，为使乳酸浓度保持一个相对低水平，利用旋转过滤器截留系统，采用灌注培养方式生产。最大的灌注速率是每2小时一个工作体积。微载体培养时，搅拌速度是一个关键的参数，L反应器中的搅拌速度是15~25rpm，当用胰蛋白酶消化、分离细胞时，这个速度一般会增加到3倍，易于消化。在消化过程中，先降低血清浓度（血清含量由10％降到1％），然后加入胰蛋白酶，当90％细胞脱落时，加入血清来使胰蛋白酶失活，然后将细胞转移到接收反应器（下一个尺寸）中。该程序由于细胞工厂放大的程度有限，使用量较多，工作强度及污染的机会较多；在提出上述程序的同时，他也提出了优化的放大程序：可以用一个20L和一个L的生物反应器取代4个CF-40和12个CF-40的步骤。相比，Baxter公司在8周内用微载体使1ml的Vero细胞放大到升的规模，细胞状态基本没有变化，该工艺采用的就是反应器到反应器间的直接放大工艺。采用15L-L-L-L的逐级放大工艺如下：复苏带有详细传代记录的Vero细胞，并传代到T形瓶和转瓶中，细胞增殖到一定程度，接种Cytodex?3微载体生物反应器，反应器逐级放大过程中，细胞按照大约1:7的比例传代到后面的生物反应器，最终的细胞密度在2-3×cells/ml，中试生产中最终的生物反应器规模是升，生产中，采用特殊的通气方式和搅拌装置，控制工艺设计，进一步放大到生产体积为L，各级放大情况见表5-1，其L批培养可获得1.8×个细胞，接毒感染复数(Multiplicityofinfection，MOI)为0.01TCID50／细胞，病毒吸附lh后加入胰酶，32℃~35℃孵育48～72h。利用该工艺成功开发了人用季节性流感裂解苗和大流行流感全病毒疫苗，并成功通过了临床试验。
表5-1不同规模的工艺放大情况
体积(L)
传代数
接种细胞
0.2
0.2*
0.2*
0.2*
第一个生物反应器
0.7
2.0
24
.5
第二个生物反应器
4.6
14.3
第三个生物反应器
32
.5
*多个转瓶
目前，国内工业化采用微载体培养动物细胞的体积较小（15~30L），且未采用反应器间的放大。但对于微载体培养动物细胞生产病毒疫苗的研究正在积极进行。如采用微载体培养Marc细胞生产猪蓝耳病病毒疫苗的研究，培养规模达到L，实现了反应器间的消化放大；采用反应器微载体培养ST细胞生产猪瘟病毒疫苗等，目前公开报告的成果是清大天一开发的微载体培养细胞从10L–50L–L–L反应器逐级放大工艺，细胞种类涵盖了Marc细胞、ST细胞、VERO细胞和MDCK细胞等。
针对市场需求，目前已有多家单位正在开发MDCK细胞、Vero细胞生产禽流感病毒疫苗工艺。因为PER.C6细胞、MDCK细胞和AGE1.CR细胞都存在专利保护及许可使用等问题，应用微载体培养MDCK细胞、Vero细胞成为一种现实的选择。但对于禽流感病毒疫苗，至少L规模以上的生物反应器用于生产病毒，该禽流感疫苗才有市场价值。采用生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗工艺过程中最大的困难是反应器微载体培养细胞的逐级放大技术的开发。目前，国内禽流感病毒疫苗研究单位与微载体悬浮培养细胞工艺开发企业进行合作，在悬浮培养MDCK细胞生产禽流感病毒疫苗的工艺开发中已取得一定成果。报道显示，采用cytodex-1微载体培养H5N1禽流感病毒，通过优化工艺，H5N1的血凝（HA）效价能稳定可达29以上，反应器微载体培养的MDCK在接种H5N1禽流感72h后的细胞大部分细胞已病变、脱落。
这些关键工艺技术的突破将为反应器培养细胞生产禽流感疫苗的产业化奠定了良好的技术基础。
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