古语有云：“工欲善其事，必先利其器”。
这话一点不假，在发现Piggybac这把利器前，小编可是吃了不少苦头。
小编之前用CRISPR/CAS9来做细胞基因编辑时，用的是ssODN（single-strandeddonoroligonucleotides，单链寡核苷酸）作为修复模板，Puro药筛3天后（小编的CAS9带puro的），混合克隆鉴定ok就直接拿来铺板，但是在后期筛选单克隆的过程中，由于KI效率很低，再加上有些肿瘤细胞本身转染效率不高，导致筛单克隆工作量超级大，整天在细胞房累死累活，到最后还是徒劳。搞得小编“香菇、蓝瘦”。
为啥小编这么喜欢Piggybac这把利器呢，因为Piggybac让筛选单克隆变得soeasy，小编再也不用整天忙得腰酸背疼手抽筋了，自从用了Piggybac，小编在做梦时都能笑醒！
好东西小编从不吝啬，闲话少说，引出我们今天的主角—Piggybac。
作为一个修复模板，整个piggybac结构需要大致包括以下几个部分（如下图）：1.左同源臂
2.5，端ITR
3.CAG启动子
4.puro抗性基因
5.GFP绿色荧光蛋白基因
6.3，端ITR
7.右同源臂
Cas9在sgRNA导向下在细胞基因组特定位点发生切割，使基因组断裂并产生缺口（图A），DSB修复利用Piggybac作为模板，精确的将piggybac结构插入基因组中(图B)，然后利用piggybac结构中带有puro抗性基因进行药筛约10d左右，药筛后就只剩下插入piggybac结构的阳性细胞，且这些细胞均带有GFP荧光，然后电转转座酶质粒将阳性细胞中插入piggybac切除，切除piggybac的细胞将不再带有GFP荧光，通过观察荧光就可以轻松筛选到KI细胞株了（图E）。
通过小编介绍Piggybac后，你是不是也觉得：原来想拿到KI细胞株可以如此简单！
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