2.2细胞的筛选和驯化细胞是病毒的表达载体，细胞质量直接影响病毒蛋白的表达量。通过细胞的改造、筛选、和驯化获得适合高密度生长、能分泌大量目标产品的细胞株(系)至关重要。根据世界疫苗制造工艺的发展趋势，能较好适应悬浮培养，短时间内大量增殖和支持病毒良好生长的悬浮细胞系是疫苗工业化生产所必需的。不同的细胞和不同的病毒对培养效果和表达量有重要影响，其筛选及驯化的原则及目标：1）细胞具有高的产品表达效率；2）细胞生长速率快，活力高，产品生产周期短，能够满足大规模生产的需要；3）培养工艺简单，规模可放大，可满足工业大规模、大容积生产；4）细胞具有较强的稳定性。为达到上述目标，目前有大量的实验室研究。但是在工业化大规模悬浮培养技术中，使贴壁细胞转化为悬浮细胞进行培养是能够快速实现该目标的一个主要方法。因为全悬浮细胞培养与贴壁细胞培养相比，培养工艺及放大工艺容易控制，操作简单且成本较低，因此，贴壁细胞悬浮化是当前工业化的研究热点。目前，除CHO细胞、BHK21细胞实现悬浮化培养应用于生物制品生产外，另外一些新的经过筛选适应后的细胞系，如MDCK?细胞、HEK-细胞、PER.C6?细胞、EB66?细胞、AGE1.CR?细胞等，已经特异性的用于病毒疫苗生产，并且这些细胞系均能够在无血清条件下悬浮生长，生产工艺简单且产品表达量较高。国际上许多知名生物制品厂家也纷纷通过细胞改造、筛选及驯化技术，发展出自己专用的细胞培养平台进行生物制品的生产，如Baxter公司的Vero细胞培养平台、Crucell公司和赛诺菲巴斯德合作开发的PER.C6?细胞养平台，GSK、Chiron及诺华公司的MDCK细胞培养平台等。因此，通过筛选和驯化，在生物反应器中实现不同细胞的全悬浮培养或者是无血清悬浮培养后，由于生物反应器大规模培养细胞自身所具有的优势，结合相应的细胞培养基和生产工艺的优化，最终较易达到提高产率及产品质量的目的。当前贴壁细胞实现悬浮化的研究方法主要有两种：一种是通过基因工程手段对细胞进行悬浮化改造，然后对改造后的细胞进行驯化；另外一种是直接通过细胞驯化技术。前者适合于贴壁性质较强的细胞，如Vero细胞、MDCK细胞等，直接进行悬浮驯化较难，在无血清条件下或悬浮培养的情况下，细胞易失去增殖能力且死亡，因此，可采用基因转染技术使该类细胞诱导表达一些抑制贴壁因子，降低细胞贴壁性，筛选出悬浮细胞株，结合适当的细胞培养基对该细胞株进行悬浮化驯化。该技术也是当前研究的热点，尤其是近几年随着流感病毒的扩大化，鸡胚生产流感疫苗的方式及产品的安全性已不能满足市场，而MDCK细胞对流感病毒具有较强敏感性，为降低成本，简化生产工艺，使得MDCK细胞的悬浮化改造构建成为研究的热点。由于MDCK细胞贴壁性较强，采用直接的驯化技术较难实现悬浮化培养，Chiachu等通过在贴壁性的MDCK细胞中导入抑制贴壁性基因，筛选出稳定表达克隆株，然后对该克隆株进行悬浮驯化实验，从而获得悬浮的MDCK细胞株，改造后的细胞在10L生物反应器中生产的病毒产量相当于个鸡胚的产量。但是由于通过改造的细胞在工业化应用中需进行大量的检测，如安全性检测等，使得这些技术应用于产业化的过程较长。因此，当前工业化中对于贴壁细胞的悬浮化应用实现还主要是通过直接的细胞驯化技术，如诺华开发的MDCK?细胞株、daelli等驯化成功的Vero细胞株等。细胞驯化的实质是对细胞进行环境条件筛选的过程，其目的是通过改变细胞的生长方式和生活环境使其适应特定的工业化需要。根据不同需要可以对细胞进行各种驯化：如贴壁依赖型细胞可以进行由贴壁生长到悬浮生长的驯化；血清依赖型细胞经过驯化可以实现无血清无蛋白条件下培养；通过驯化细胞可以提高细胞对有毒代谢物的耐受力，延长培养维持时间，提高产物浓度等。工业上对细胞的驯化主要包括贴壁细胞的悬浮化驯化和悬浮细胞无血清驯化，为提高驯化的成功率及缩短驯化的时间通常将二者结合使用。为实现稳定的驯化，通常由高浓度血清培养逐渐降低血清浓度进行培养，通常无论是何种驯化，一般都由高密度细胞培养向低密度细胞培养。MartinS.Sinacore等曾以CHO细胞为例介绍了一种三步法使细胞从贴壁、依赖血清的条件下驯化成无血清全悬浮培养。该方法第一步是使贴壁细胞悬浮化：在Spinner中使用含血清、胰岛素的细胞培养基使贴壁细胞驯化成全悬浮细胞；第二步是无血清驯化：利用添加生长刺激因子的细胞培养基，采用逐步降低血清的方法，使全悬浮的细胞从血清培养条件逐渐驯化成无血清培养；第三步是适应生物反应器的驯化：在生物反应器中驯化培养细胞使其适应高密度生长，使其能够耐受高密度下细胞分泌的细胞抑制生长因子，以适应生产大规模培养期其高活力及高稳定性。虽然不同的细胞特性有所差异，但该方法具有一定的普适性，此后许多研究者在对细胞进行驯化时借鉴了该法。2.2.1贴壁细胞全悬浮驯化全悬浮驯化即是使某些贴壁细胞能够在悬浮培养条件下生长，实现该目标常用的方法有两种：选择法和适应法。1、选择法：将贴壁细胞消化分散后，以较高密度接种（至少达2×cells/ml）进行悬浮培养，然后再静置贴壁培养，如此重复多次后，其中有些细胞能在瓶壁上停留呈圆形，但仍可进行有丝分裂和增殖。将能在静态悬浮液中生长和分裂的活细胞收集即可以进行悬浮培养。2、适应法：即通过持续振荡、搅拌等机械手段将培养物保持在悬浮状态，该法可使相当多的细胞系适应悬浮培养。Capstick等采用此法使BHK21细胞在悬浮培养中获得成功，具体方法如下：1)用含胰蛋白酶（0.1%）和EDTA(0.01%)的混合液分离单层细胞，制备悬浮细胞；2)在至少2～3个或更多的大型培养瓶（如摇瓶、Spinner）中，加入无Ca2+、Mg2+的细胞培养液；3)调整细胞浓度使之至少达到5×cells/ml，以最低搅拌速率开始搅拌或振荡，以保持细胞均匀地混合；4)每隔24小时取样进行细胞计数和细胞活力测定；5)每3天从细胞培养液中取出培养物，经离心（rpm，5min）后，调整活细胞浓度至少达2.5×/ml，重新悬浮培养；6)如果在培养换液时发现有细胞贴壁，可以用含胰蛋白酶(0.01%)和EDTA(0.01%)的混合液，搅拌消化，离心收集分离细胞；若发现悬液中细胞结团较严重时，也可加入含胰蛋白酶和EDTA的混合液使之分散。这种处理通常在第一次和第二次换液时是必要的，但在此后就很少再使用到。如果细胞悬浮培养时持久地结团，可在生长液中加入50μg/ml的胰蛋白酶；7)成功适应悬浮培养的标志是换液时发现细胞数量增加，待在一定培养时间内可获一致的细胞产量时，说明适应后的细胞已有一个恒定的生长率。该法需要的时间较长，在过程中需要注意控制操作
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