人羊膜上皮细胞和胶原蛋白支架在促进脑外伤恢复中的协同作用
作者：ZhiyongChena，来自于美国银泉WalterReed陆军研究所精神病学和神经科学部应用神经生物学系
年发表于《brainresearch》,if:2.
摘要：穿透性脑损伤的组织病理学结果是形成了一个永久的腔。在目前的研究中，使用穿透性颅脑损伤模型（PBBI），直接将人羊膜来源的多能祖细胞（羊膜上皮细胞）注射到损伤腔，细胞死亡，这个现象表明细胞的存活需要一个支持的基质。在本篇研究中，作者将hAECs种到胶原蛋白支架上，然后注射到脑损伤模型的损伤腔，研究了细胞的存活和神经保护作用。将hAECs悬浮到其细胞条件培养液（ACCS）中和液态的胶原蛋白中，然后立刻注射到脑损伤模型的损伤腔中，损伤对照组大鼠只注射了液态胶原蛋白支架，所有大鼠在移植两个星期后处死。与我们先前的结果一致，所有注射进损伤腔的悬浮在ACCS中的细胞都死亡了，而且，在损伤部位单独注射细胞后也没有发现胶原。相反，注射进损伤腔的hAECs+胶原蛋白支架组，细胞保留在了损伤腔。另外，hAECs+胶原蛋白支架组保留了损伤腔一些明显的脑组织，并且内源性脑神经前体细胞和星形胶质细胞在损伤脑组织中有明显的浸润。作者发现hAECs迁移到脑室下区和胼胝体。并且，hAECs+胶原蛋白支架组可有效减轻PBBI诱导的胼胝体和同侧丘脑轴突变性，改善运动功能障碍。总的来说，胶原蛋白支架为hAECs的存活、迁移和神经保护提供了一个支持基质。
1.简介
创伤性颅脑损伤（TBI），是致死致残的主要原因。TBI的发生率占所有损伤的比例已经超过20%。并且，大约每年有万患TBI。但是目前临床上没有有效的方案去减轻损伤，恢复损伤的神经元的功能。干细胞的移植为脑损伤后修复提供了一个有效的治疗方法。
像神经干细胞一样，hAECs具有保护和替代受损神经元的潜能，而且它致瘤性低。另外，hAECs容易获得，因为它来自于剖宫产后废弃的脐带，依赖于培养基。可以传到3~5代。这些移植后的hAECs不但可以在大脑中存活，还可以促进多巴胺能神经元的存活。最近，作者报道了PKH-26标记的hAECs可以注射进脑室，他们可以存活，迁移甚至可以为PBBI实验模型提供神经保护。然而，当把细胞直接注射到损伤部位，没有检测到活着的PKH-26标记的hAECs。在PBBI实验模型中，永久性空腔的形成代表着对细胞生存至关重要的结构支架的重大损伤。这种结构支架的损伤会导致与细胞外基质蛋白质发生的联系的中断，这就可以解释为什么直接将hAECs直接注射到损伤部位，观察不到hAECs活细胞。
考虑到结构支架的丢失，组织工程成为一种有前景的方法，可以改善移植细胞的活率，使移植的细胞能够发挥修复人体受损的器官或者组织的作用。组织工程的原则是将细胞种植到人工的ECM，细胞可以在该ECM上粘附、增殖分化。这是因为人工的ECM对大多数正常哺乳动物细胞存活很关键。因为ECM蛋白质为移植的细胞提供一个粘附和结构支持，以及介导多种细胞信号通路。来源于ECM的生物支架蛋白质已经成功运用到大量组织工程、再生医学中，有运用到临床的，也有临床前的。因为胶原蛋白支架主要是ECM中的不溶性纤维蛋白，很有前途成为一个支架材料。脑组织一般只表达IV型胶原，然而，证据证明IV型胶原会促进瘢痕形成、抑制轴突再生，因此并不是促进干细胞生存和结合到宿主受伤脑组织的理想材料。相反的，Ⅰ型胶原蛋白可以成功的运用于神经干细胞/祖细胞的3D培养。
作者的研究目的是在PBBI模型组上运用组织工程是否可行。为了确定一种合适的方法将hAECs细胞直接移植到损伤部位，从而最大限度地发挥其治疗作用，作者将未分化的hAECs种植到Ⅰ型胶原蛋白上，将混合物直接注射到模型的损伤腔，评价细胞的生存和神经保护作用。
2.结果
2.1PBBI14天后病变腔和轴突变性的发展
PBBI损伤开始于大脑右半球的前极，延伸至纹状体前部。损伤后第一天，前额会出血性坏死。大脑的病理切片表明退化的细胞是沿着受伤的路径。损伤后第三天，损伤后的早期特征仍然很明显，组织变性扩大，产生可见的空洞。损伤后的第七天，腔的体积由于损伤组织的清除而增加，损伤后2周彻底形成空腔。原发性损伤激发了延迟的二次损伤。
2.2激活了PBBI内源性神经干细胞（诱导内源性）
损伤周围，远至丘脑的nestin染色很明显，这表明激活了损伤区内源性神经干细胞。假手术组和PBBI模型组的对侧脑半球，nestin阳性的神经前体细胞广泛分布于脑内，但分布稀疏。相反的，在PBBI模型组的同侧脑半球，神经祖细胞被广泛的激活，PBBI腔、胼胝体、下丘脑周围布满了nestin阳性的神经前体细胞。
2.3hAECs和胶原蛋白支架在PBBI模型中的协同作用（细胞存活）
当hAECs被单独注射到PBBI模型的空腔中时，在大脑的任何部位都没有检测到hAECs，同样的，单独将胶原蛋白支架注射到PBBI模型的空腔中时，没有观察到任何细胞，然而，将hAECs悬浮在液态胶原蛋白之后一起注射到空腔中时，嵌入胶原的hAECs活细胞被检测到，并且部分填充在空腔中，另外，剩下的一部分hAECs迁移到胼胝体和室下区。
2.4损伤部位的hAECs+胶原蛋白支架减弱了PBBI诱导的胼胝体和同侧丘脑的远端轴突退化（减慢轴突退化）
轴突退化可以通过测量来进行量化。与假手术组或者胶原蛋白支架组相比，hAECs+胶原蛋白支架的复合体可以有效减少丘脑和胼胝体中的轴突退化（有显著性差异）。
2.5hAECs分化不全和活化的星形胶质细胞和神经前体细胞无法在保存组织中的保存/浸润
通过荧光检测神经元标志物的免疫组化染色来确认是否hAECs在移植后会分化成为神经元，FITC荧光和PKH26共定位会指明分化的hAECs，尽管GFAP，nestin，S-andMAP-2阳性细胞广泛的分布在皮质和皮层下结构，但是却没有大量的PKH26标记的细胞出现在空腔、室下区和胼胝体（hAECs没有分化成神经元）。
然而，大量的内源性星形胶质细胞和神经祖细胞被检测到，存在于处在损伤腔的剩余的hAECs/胶原蛋白/组织基质上。这和PBBI模型组相反，病变腔组织损伤，没有任何的活细胞。值得注意的是，存活的内源性星形胶质细胞形成了瘢痕组织。
2.6运动功能的改善
运动协调、平衡、耐力通过旋转任务来评价。PBBI之后旋转功能受损。如果只用胶原蛋白支架，对修复没有作用，但是将结合有hAECs的胶原蛋白移植到空腔时，会有效促进功能恢复，因为在每一个连续速度下旋转杆下降的潜伏期显著增加。
3.讨论
TBI后，由于大脑的可塑性，部分功能由于轴突的修复和再生是可以恢复的，比如：成年人大脑中神经干细胞修复或者替换受伤的脑组织，并且证明神经干细胞会迁移到受伤部位，增加促进功能恢复的生长因子的表达。然而，尽管数据表明，TBI后，内源性神经干细胞会被广泛激活和迁移，但是，仅仅通过刺激这些内源性细胞来修复组织的证据仍然缺乏。将神经干细胞移植到受伤的大脑和脊髓腔中，会有一些功能恢复。但是也有随之而来的问题，就是移植细胞的存活以及移植融合抵抗，造成这些问题的原因是脑组织细胞在正常环境中的损失。
与这些报告一致的是，在目前的研究中，PBBI激发了神经干细胞的激活以及向受伤的半影和二次损伤部位的迁移。然而，没有在损伤腔中检测到内源性神经干细胞，可能是缺乏支持基质。大部分正常的哺乳动物细胞与ECM分离时是不能生存的。然而，PBBI之后永久性空腔的形成意味着非常严重的结构支持的损失，这对外源性神经干细胞（移植的）和内源性神经干细胞的生存都是至关重要的。没有这个结构支持，组织修复和移植的神经干细胞存活会严重受阻。
本篇文章的结果表明损伤腔中hAECs的存活是生物支架材料构建的三维结构环境的结果，形成了组织工程。组织工程作为一个TBI伤后恢复的生物技术，依赖于新的生物材料支架提供一个内源性的，本地化的环境，促进细胞增殖和分化。除了为细胞移植创造一个合适的环境，这些支架材料同样可以释放信号分子和营养因子。已经证明，细胞外基质（ECM），提供的不仅仅是一个移植细胞用来粘附的支架，同时也是细胞增殖、分化和形态形成的自然环境。因此组织工程方法代表了一个可优化细胞移植结果的方法。目前的研究结果表明，hAECs和ECM之间有协同作用，并且这个协同作用有促进TBI后恢复的潜能。尽管单独将hAECs和ECM注入到损伤空腔中，细胞和材料都没有保存到空腔中，但是两者一起注入到损伤大脑中时出现了协同作用。
用于研究的支架是Ⅰ型胶原蛋白，但是Ⅰ型胶原蛋白会在肌腱、皮肤、骨头和血管壁中表达，但没有脑组织。这个Ⅰ型胶原蛋白已经成功用于神经干细胞的3D培养。我们的研究结果进一步证实了I型胶原在体内脑组织工程中的应用。本研究中观察到的胶原蛋白增强干细胞存活的一个可能的解释可能来自早期的证据，即干细胞通过表面胶原结合蛋白或胶原受体键合到胶原蛋白，比如：整合素，胶原结合免疫受体，盘状结构域受体。
在组织工程中，控制移植的支架在受损区域存留的时间对促进创伤后恢复至关重要。理想的支架必须能够保留足够长的时间去充分支持移植细胞的存活和分化，以及宿主组织环境中最初的原始组织合成，这可能需要几个星期。本研究中hAECs和胶原蛋白支架的协同作用表明干细胞可能会提高支架抗降解性能，但是这个机制尚不清楚。可能的机制是hAEC会通过其胶原蛋白表面结合蛋白或胶原受体增加胶原蛋白的交联，其他另一个可能的解释是hAECs可能会抑制免疫反应，因此阻碍了支架的降解和清除。另外，hAECs抑制外周血单个核细胞增殖。还有，hAECs通过旁分泌机制发挥作用。hAECs会生成多种多样的细胞因子，包括：血小板源性生长因子，血管内皮生长因子，血管生成素，转化生长因子β-2，基质金属蛋白酶组织抑制剂-1和基质金属蛋白酶组织抑制剂-2，其中的任何一个因子或者所用的因子都有可能局部发挥作用，减慢支架的降解。
其他的结果也证明了hAECs具有分化成神经干细胞和神经元细胞的可能性。然而，在本研究中，hAECs分化后的细胞没有被发现。这与我们之前的发现，即单独将hAECs注射到PBBI损伤腔中的结果一致。因此，移植的hAECs可以减弱PBBI诱导的轴突降解以及改善运动功能这一发现表明神经回路的重建可能不是促进神经保护和功能恢复的关键组成部分。
大量可能的机制可以解释观察到的hAECs调节神经保护。移植的hAECs细胞可能会释放神经递质，比如多巴胺、乙酰胆碱、GABA，或者生成神经营养因子，对抗神经元变性或者促进再生。同样地，移植的细胞可能会通过诱导其产生的营养和生长因子影响宿主细胞的反应，反过来提供自我保护和神经保护。是否该保护作用是局部的，仅在最初损伤的位置，或者远一点，在二次损伤位置，还没有被证明。
必须注意到的是，除了丧失结构支持，充分证据证明TBI后脑外伤急性期兴奋性毒性和炎症机制会导致移植的hAECs存活率下降。然而，目前的研究结果表明组织工程的应用可以促进TBI后脑外伤急性期移植细胞的存活。
hAECs-胶原蛋白支架保留了损伤腔中明显的神经组织。根据他们的组织学，这些组织正在退化。然而，这些组织反过来作为内源性神经干细胞和星形胶质细胞浸润的基质。尽管在保留的组织中没有发现神经元（或者内源性神经元或者hAECs分化的神经元），但是这个新移植的形态似乎是重建损伤腔的开始，这个可能反过来有助于这些受伤的动物进行神经功能的改善。因此，hAECs成为替代药物和ES细胞的TBI后的治疗方法。像本篇文献所描述的，AMP细胞和生物支架材料的结合有潜力去保护或者替代受损的神经元，为TBI后的治疗提供了新的方向。(以下为原文)
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