今天我们邀请冰糖来介绍lentiCRISPRv2应用指南。
lentiCRISPRv2说明克隆gDNA使用BsmBI位点，载体可以切出一个~1.9kb的filler片段，便于confirm酶切成功并利于载体回收。
BsmBI的位点如图所示，酶切之后不需要CIP脱磷也不会自连。
Cas9的COOH端带有FLAGtag，可以WB或者Immunostaining。
EFSpromoter被优化的小而强，极大提高了慢病毒包装的效率。
载体带有Puromycin抗性，可以富集转染/感染成功的细胞。
参考文献：
Improvedvectorsandgenome-widelibrariesforCRISPRscreening.SanjanaNE,ShalemO,ZhangF.NatMethods.Aug;11(8):-4.doi:10./nmeth..10./nmeth.PubMed
gDNA设计说明gDNA设计方法和原则请查看「CRISPR/Cas9系统操作指南一」。请加颜值担当菌菌，。注明protocol就会给到你《CRISPR/Cas9系统操作指南一》。
对于lentiCRISPRv2克隆，其合成的oligo末端和pX不同，请注意设计。
举个例子说明（千万注意oligo的方向）
载体克隆说明Backbone的酶切体系与文章「CRISPR/Cas9系统操作指南一」一样，不脱磷处理参考图1中的操作，脱磷处理参考图2中的操作。
Oligo的退火条件也与文章「CRISPR/Cas9系统操作指南一」一样。
注意：如果载体不脱磷，oligo不需要磷酸化；载体脱磷参考图2（FengZhang提供的protocol，设计脱磷，可以参考），oligo就需要加磷处理。
图1
图2
病毒包装体系包装病毒使用的包装体系如下（formmdish，6xT）
4μglentiCRISPRv2-gDNAplasmid3μgpsPAX2packagingplasmid
2μgpMD2.Genvelopeplasmid转染条件：用细胞转染试剂lipofiter。DNA:lipofiter=1μg：2.5μL
收集48h和72h病毒上清，待用。
此处病毒包装的protocol没有列出，如果想看，请加颜值担当菌菌，。注明protocol就会给到你《CRISPR/Cas9系统操作指南一》。
目的细胞系的感染转染（2μgplasmid/60mmdish，细胞密度60～80%）
感染（1～5mL病毒上清）
KO单克隆的获取有限稀释法：50～cells均匀分到96-wellplate
单克隆挑取法
KO单克隆的鉴定直接测序或者T7E1或者酶切鉴定：鼠尾直接PCR试剂盒(快速基因型鉴定)，直接取细胞进行PCR，然后测序或者做T7E1或者酶切鉴定即可。
测序看套峰
T7E1assay
酶切鉴定
WB鉴定
如果抗体好用，直接用Dotblot也很快，通量高。
文章来源：文章由冰糖授权
图片来源：网络及冰糖提供
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