CAR-T疗法涉及到多个生物学领域，例如基因工程，细胞生物学，肿瘤免疫学，合成生物学，靶点鉴定，细胞制备等等。
靶向CD19的CAR-T疗法的三位先驱之一，纪念斯隆-凯特琳癌症中心的MichelSadelain教授（其他两位是宾大的CarlH.June教授和美国国家癌症研究院的StevenRosenberg教授）近日撰文对CAR-T疗法中涉及到的嵌合抗原受体（CAR）转染方法及T细胞制备这两大领域进行了总结。
1.1嵌合抗原受体（CAR）转染方法
i.运用γ-逆转录病毒和慢病毒载体（γ-RetroviralandLentiviralVectors）
年γ-逆转录病毒首次在小鼠T细胞上实现了外源基因转导，之后成功运用于人的T细胞基因工程改造并沿用至今，逆转录病毒将自身基因组及其携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，可实现目的基因稳定、长期的表达。逆转录病毒表达系统根据不同的包装细胞系可分为单嗜性、双嗜性和泛嗜性，不同包装细胞产生的逆转录病毒能够特异性地感染某一个或某一类宿主，但是，逆转录病毒不能感染非分裂细胞如肌肉、大脑、肺及肝组织中的这些可以做为基因治疗靶细胞的重要细胞。慢病毒载体较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，并且慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。载体DNA整合至宿主细胞致癌基因附近导致的插入突变是一个与所有载体有关的潜在安全问题。慢病毒整合位点常远离启动子，而逆转录病毒载体整合的位点常位于转录起始位点，说明慢病毒载体致变异的可能性较低。
ii.非病毒基因转染方式，包括“睡美人（SleepingBeauty，SB）”转座子系统和mRNA电转（DNATransposonsandRNATransfection）
γ-逆转录病毒和慢病毒载体的运用较为复杂，虽然能够获得较高的转导效率，但对其进行生物安全性检测以及储存花费较高，因此有研究者用非病毒的方式来构建CAR-T，例如电转可以表达CAR/TCR的mRNA。还有一种具有较大研究价值的基因修饰手段被称为“睡美人”转座子/转座酶系统，具有生产、检测工艺简单，低成本，随机整合安全性高等优点，但转导效率需进一步提高。
iii.基因组编辑（GenomeEditing）
运用当今三种主要的基因组靶向编辑技术ZFNs(Zinc-fingernucleases，锌指核酸酶)、TALENs(Transcriptionactivator-likeeffectorsnucleases，转录激活子样效应因子核酸酶)和RNA介导的CRISPR-Cas9系统对T细胞基因组进行靶向编辑。目前已经证实利用CRISPR-Cas9系统在基因组的TCR基因座上敲入CAR基因可以诱导T细胞产生强烈的抗肿瘤活性。因此，基因组编辑的方式同样具有良好的应用前景。
总而言之，目前基因整合方式包括有γ-逆转录病毒、慢病毒、“睡美人”转座子系统或mRNA转染、mRNA电转等，相对而言，目前慢病毒有不可替代的优势。
1.2T细胞制备
i.自体T细胞（AutologousTCells）
临床数据表明，CAR-T在B细胞恶性肿瘤治疗中取得了很好的疗效，并且目前采用的方法都是自体过继细胞治疗（AutologousAdoptiveCellTransfer，ACT），即从患者体内分离出T细胞，利用基因工程技术给T细胞加入一个既能识别肿瘤细胞，又能激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体，使T细胞变身为强大的CAR-T细胞，最后把增殖好的CAR-T细胞回输到患者体内。这些分离得到的T细胞表型各异，分化状态也不同，比如离开胸腺后幼稚T细胞（TN）分化为干细胞样记忆性T细胞（TSCM）、中央记忆T细胞（TCM）、组织记忆性T细胞（TRM）、效应记忆T细胞（TEM）、效应T细胞（TE）等等，目前研究表明选择幼稚T细胞（TN）、干细胞样记忆性T细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（TCM）进行基因改造，治疗效果会更好。
ii.通用型T细胞（AllogeneicTCells）
自体过继细胞治疗（AutologousAdoptiveCellTransfer，ACT），这种方法昂贵并且耗时。对于接受化疗的患者、HIV感染造成的免疫缺陷患者、新生儿及老年患者，很难获得足量且状态良好的淋巴细胞用于CAR-T细胞治疗。因此目前CAR-T细胞治疗的一个重要研究方向是怎样使用一个健康献血者的T细胞制备大量的CAR-T细胞，满足数百名患者的临床使用。这一技术的建立将极大降低CAR-T疗法的成本，可以更好的保证统一制备的细胞质量，而且患者在需要时可以马上得到CAR-T细胞进行治疗。使用异体T细胞制备通用型CAR-T用以治疗多个患者，必须保证其安全性，确保过继细胞不能攻击患者自身细胞，同时需要降低其自身的免疫原性避免宿主细胞的攻击。制备异体CAR-T细胞需要进行多基因同时编辑，CRISPR-Cas9这一RNA介导的DNA核酸酶系统是非常适合的技术平台。利用CRISPR-Cas9技术将αβT-cellreceptor(TCR)从异体的CAR-T细胞中敲除，避免移植物抗宿主病（graft-versus-host-disease，GVHD）的发生，将人类白细胞抗原（HLA）敲除降低自身的免疫原性，可以获得大量可用于异体治疗的CAR-T细胞。另外，考虑到阻断PD-1信号通路在许多肿瘤类型中都取得了较好的疗效，研究人员同时在CAR-T细胞中敲除了PD-1基因，来阻断PD-1信号通路，也取得了良好的效果。
缺乏同种异体反应性的病毒特异性T细胞（Virus-specificTcells，VSTs）同样可以用来作为TCR或CAR的载体细胞，进行同种异体过继细胞治疗。
iii.其它来源的T细胞包括淋巴样祖细胞和多能干细胞（LymphoidProgenitorsandPluripotentStemCells）
T细胞的选择并不局限于成熟T细胞，T细胞的前体细胞、由胚胎干细胞或人工诱导多能干细胞分化而来的T细胞都可以进行基因改造并获得较好的抗肿瘤能力。
iv.调节性T细胞（RegulatoryTCells）
CAR-T疗法的应用前景并不局限于肿瘤治疗，由于调节性T细胞（Treg）具有免疫调节的功能，CAR改造的调节性T细胞（CAR-Treg）可以用来治疗自身免疫病，以及保护移植器官避免来自宿主的攻击。CAR-Treg治疗自身免疫病已经在小鼠寻常型天疱疮的治疗中得到了验证。
细胞和基因工程技术的进步使CAR-T疗法变的日趋高效和易于掌控，然而，CAR-T疗法也面临着众多的挑战，例如，CAR-T疗法所伴随的细胞因子风暴及移植物抗宿主病（GVHD）等，以及靶点的筛选和如何突破免疫抑制性肿瘤微环境等，都需要我们在日后的实践中逐一克服。
原始出处：
IsabelleRivière1MichelSadelain.ChimericAntigenReceptors:ACellandGeneTherapyPerspective.MolecularTherapy:theJournaloftheAmericanSocietyofGeneTherapy,
