对于Biologicaldog来说，没有高质量的实验样本，就没有好的实验结果（就不能毕业）。
而对于正在/将要做westernblot的Biologicaldog来说，优质特异的蛋白样品可是实验制胜的关键。
你准备好了吗？蛋白怎么抽提？选择什么方法？用什么试剂？
就知道你不会，跟着试剂君一起学习吧~
蛋白样品制备需要「知己知彼」
需要明确的是，目的蛋白因其物种来源和组织特异性的不同，在种类和性质上有很大差异，并没有一种制备方法可以适用于所有蛋白的提取。
这就需要我们进行全面的分析后(多看文献，多问师兄)才能选择最合适的蛋白制备方法，而遵循的一个基本原则是「知己知彼」。
首先，「知己」是要了解：
样品是来自什么物种？
目的蛋白定位在哪种组织或细胞器？
是可溶蛋白还是不可溶蛋白？
是高丰度蛋白还是低丰度蛋白？
在制备时需要保持蛋白的天然活性，还是需要变性蛋白？
其次，「知彼」是要知道：
哪种方法或试剂能够防止蛋白降解、聚集、沉淀、变性、修饰？
哪种能够去除高丰度蛋白干扰，富集低丰度蛋白？哪种能去除核酸、多糖、脂肪等杂质？
「知己知彼」之后，就可以根据需要选择合适的试剂了，我们接着往下看。
裂解液的选择裂解液是最普遍使用的蛋白提取试剂，可根据文献或经验自行配制，也可购买商业化的产品。常见的细胞裂解液有NP40、TritonX-、RIPAbuffer等。下表是根据目的蛋白的不同定位选择裂解液的建议。
蛋白抽提试剂盒的选择虽然裂解液的使用范围比较广泛，能够满足总蛋白的提取，但是无法做到特异蛋白的提取，特别是遇到低丰度蛋白或者活性蛋白功能分析时，通用型的裂解液存在很大的局限性。
蛋白抽提试剂盒的出现弥补了细胞裂解液的应用局限性，特别是针对难提取的样本或者亚细胞器蛋白的提取。
例如：针对植物、动物组织/细胞、细菌、酵母等不同样品及细胞核、细胞膜、线粒体、叶绿体、溶酶体等不同亚细胞器的专业提取试剂盒。
这类特化试剂盒能够针对目的蛋白的不同来源和不同组织定位进行裂解和提取，简化实验操作的同时还能提高蛋白提取的得率。
以Invent公司的Minute?系列蛋白提取试剂盒为例：
一方面，该系列试剂盒有非变性的裂解配方，可最大程度地保留蛋白活性；
另一方面，该系列产品无需经过反复冻融、超声破碎等传统物理裂解方法，并能在很短时间内得到高纯度的蛋白。
举个栗子：膜蛋白提取试剂盒（SM-），通过非变性裂解配方，只需45分钟即可得到具有天然活性的多层跨膜蛋白，且能够有效地去除多糖、核酸等杂质。
虽然今天试剂君可耻的给invent打广告了，但我向你们发4，我绝对没有收广告费，如果大家遇到Invent的销售，请告诉他们请我吃火锅。
WesternBlot中的蛋白样品危机在WesternBlot中如果蛋白样品制备不当，可能会造成无信号、弱信号、条带大小不正确等实验问题。别怕，有试剂君在呢，会给你出可多可多好主意了。
无信号、弱信号
可能的原因有：
样品中不含待检测蛋白；
样品蛋白含量低；
上样量低；
蛋白降解。
对应的解决方案是：
确定目的蛋白的定位，优化蛋白提取方法；
去除高丰度蛋白，富集低丰度目的蛋白；
增加电泳上样量；
添加合适的蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂。
条带大小不正确
可能的原因有：
蛋白具有多种剪接体；
蛋白存在二聚体或者多聚体。
对应的解决方案是：
查阅文献或通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码mRNA
增加上样前煮沸变性时间
多带现象
可能的原因有：
细胞传代次数过多，使其蛋白表达不同；
蛋白具有多种修饰形式
蛋白样本降解
对应的解决方案是：
使用原始未传代的细胞株，做对照实验
是否存在糖基化、磷酸化、羟基化？去磷酸化、去糖基化后来验证翻译后的修饰
冰上操作，避免污染，确保加入蛋白酶抑制剂
以上是关于WesternBlot实验过程中如何选择合适的蛋白制备方法和试剂的一些建议，以及由于蛋白样品制备不当造成实验失败的问题总结，希望能给大家一些帮助和启发。
此外，WesternBlot还有很多关键的实验环节需要注意，比如怎样选择高质量的抗体和适合自己的蛋白Maker，还有传说在一天内做完westernblot的神级操作，在之后的篇章里会逐步为大家介绍，请大家持续北京治疗白癜风的最好医院有人去过北京中科医院
