项目简介:
慢病毒载体(Lentivirus)是以HIV-1病毒(人类免疫缺陷1型病毒)为基础,经基因工程改造而成的应用型工具。相对于普通载体,它可以高效地感染多种类型难转染细胞,另外,它还可以将携带的外源片段有效地整合到宿主基因组,达到持久、稳定表达的目的。
实验流程:
一、载体构建:
过表达载体:
1、准确查找目的基因序列(注:客户也可自行提供序列);
2、根据确定的序列进行全基因合成与测序鉴定;
3、将目的片段克隆到慢病毒载体并进行鉴定;
基因沉默载体:
1、根据目的基因序列信息,设计并构建目的基因shRNA载体和阴性对照shRNA载体;
2、干扰靶点筛选:将shRNA转染细胞,通过qPCR检测目的基因的mRNA表达量,筛选出沉默效果最好的shRNA;
3、根据筛选到的shRNA序列构建到shRNA慢病毒载体上,测序验证;
二、病毒包装:
1、过表达质粒/有效干扰片段质粒结合包装质粒在T病毒包装系统内进行慢病毒包装;
2、生产、收集、纯化病毒液;
三、稳定细胞株构建:
1、目的基因病毒与阴性对照病毒感染目的细胞;
2、抗生素筛选;
3、目的基因稳定株与阴性对照稳定株建立与检测;
提供结果:
1、实验方法与结果报告单;
2、实验原始数据;
3、病毒液(注:不做稳定株筛选的客户),目的基因与阴性对照稳定细胞株(注:做稳定细胞株筛选的客户);