N6-甲基腺苷（m6A）
图丨mRNA修饰途径方法（来源：Cell）
早在20世纪70年代，科学家们就在RNA中发现了m6A修饰，但一直由于技术制约其功能未能被很好的揭示。直到年，科学家们的研究表明，m6A修饰和mRNA的稳定性、剪接加工、翻译以及microRNA的加工有关。此外，m6A还和干细胞命运、生物节律相关，可以促使干细胞从自我更新状态转向细胞分化，研究人员发现，甲基化会缩短mRNA的半衰期，减少其丰度。可以说，m6A修饰几乎影响RNA代谢的每个步骤。
mRNA中m6A修饰研究虽然已经取得了实质性进展，但仍然存在一些技术挑战和基础科学问题。第一，目前在转录组范围内检测m6A的方法主要依赖于m6A抗体富集，与其质量密切相关，抗体选择不当将造成假阳性；第二，MeRIP-Seq（RNA甲基化测序）方法只能将m6A残基定位在~nt（nucleotide，nt指核苷酸）的转录本区域中，无法在全转录组水平上鉴定m6A的精确位置；第三，其它RNA结合蛋白免疫沉淀方法一样，对于一些小样本或珍贵样品不适用；第四，为什么m6A甲基化酶只对一些mRNA起作用而不是全部，是否还存在其它甲基化相关酶以及这些酶之间是如何协调作用的？第五，其它RNA修饰与m6A之间是否存在联系，它们是否一起调节某种转录物的生物学过程？这些问题仍有待进一步研究。
2-O-甲基化（Nm）
关于5帽子的2-O-甲基化修饰（Nm），一般认为5帽子可以促使mRNA和核糖体的结合，能有效地封闭RNA5末端，以保护mRNA免疫5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定性。此外，5帽子还参加mRNA前体的剪接，参与mRNA3末端多聚腺苷酸化，mRNA从核中到细胞质中的运输也需要5帽子的参与。
年，Wei等发现帽结合蛋白（capbindingprotein，CBP）可以与ploy(A)绑定蛋白(PABP)相互作用，拉近了5帽子与ploy(A)尾的距离，形成的环状结构可以加强帽结构与CBP的亲和力，加快核糖体的循环，从而提高翻译效率。(图A)
图丨5帽子的功能示意图（来源：生命科学）
年，Daffis等发现病毒RNA5帽子的2-O-甲基化修饰可以使其逃脱宿主的抗病毒应答，细胞质RNA5帽子的2-O-甲基化修饰可能是宿主区分自身RNA和外来RNA的一个重要标识。哺乳动物细胞对5帽子没有2-O-甲基化修饰的病毒具有天然的免疫，因为IFIT1(interferon-inducedproteinwithtetratricopetiderepeats1，干扰素诱导的四肽重复蛋白1）可以与这类病毒mRNA结合，使其不能被翻译。（图B）
假尿嘧啶（ψ）
假尿嘧啶修饰是最丰富的RNA修饰，一般由尿苷的异构化产生，已有的研究表明，mRNA的假尿嘧啶化修饰主要有三个功能：改变密码子、增强转录本稳定性和应激反应应答。mRNA假尿嘧啶化修饰的过程是由假尿嘧啶合成酶（pseudouridinesynthases，PUS）进行催化，让尿嘧啶核苷酸（U）化学结构发生改变，形成假尿嘧啶核苷酸。之前研究已在tRNA、rRNA、snRNA中发现了大量的假尿嘧啶，最近的研究证实假尿嘧啶同样存在于mRNA中。
年，Karijolich等发现，mRNA上的假尿嘧啶化修饰可以改变密码子。将酵母中的密码子中的尿嘧啶(U)替换为假尿嘧啶，这些密码子就能编码氨基酸，年，Schwartz等发现，酵母发生热休克时，会由Pus7p（一种蛋白）额外引入超过个假尿嘧啶修饰位点，如果敲除PUS7基因，则那些含有新引入修饰的mRNA会减少，这说明着假尿嘧啶修饰可能会增强转录本稳定性。
虽然以上三种修饰已被广泛应用于mRNA药物的生产过程中，但关于mRNA修饰点位的探究才刚刚开始，检测技术的局限性仍有待突破。ψ-seq和RiboMeth-seq（两种测序技术）对假尿嘧啶化修饰和2-O-核糖甲基化修饰位点的定位可以达到单核苷酸的精度，但对m6A位点的定位精度还不够高。
此外，还有很多RNA修饰缺乏相应的技术手段去深入研究。因此，在技术方面还需要有更多的“NGS+”型(传统检测手段与高通量测序相结合)的高通量技术产生。最近，纳米孔技术是一种新颖的单分子方法，已显示对m6A的单碱基分辨率检测，科学家认为，这种单分子方法可能会成为一种新颖的范例，可以同时检测不同的RNA修饰。
