一、 试剂、耗材（略）
二、仪器设备（略）
三、试剂及配制（略）四、酵母双杂交文库构建实验流程1、Trizol法RNA的提取RNA电泳图如下：`2、使用OligotexmRNAKits（Qiagen）分离纯化样本的mRNA，mRNA质量可以满足文库要求，mRNA总量为6.9ug，电泳检测图片如下3、酵母双杂交文库构建3.1第一链cDNA合成3.2cDNA第二链的合成3.3加5’接头(3个读码框，每个读码框连接一份，共3份)3.4cDNA长度分离，使用低熔点琼脂糖电泳cDNA，切胶回收1Kbp以上的条带，乙醇沉淀后溶于14μL水中。3.5使用Infusion重组反应体系连接cDNA与载体pGADT73.6电转化大肠杆菌感受态细胞4、酵母双杂交文库的构建质量鉴定4.1库容量的鉴定取转化后细菌原液10uL稀释倍后，从中取出10uL涂布LB平板（含氨苄抗性），第二天计数。CFU/mL=平板上的克隆数/10uL×倍×1×uL文库总CFU=CFU/mL×文库菌液总体积（mL）4.2插入片段大小鉴定从转化平板上随机挑取24个单克隆菌落，经PCR扩增后，用电泳检测PCR产物大小。结果如下图所示：
五、文库扩增及质粒提取将转化后原始文库菌液涂布氨苄抗性培养基平板扩增培养，第二天用液体培养基从平板上洗脱菌苔，取其中2/3体积用Qiagen大抽试剂盒抽提质粒DNA，剩余1/3体积中加入25%无菌甘油混合均匀后灌装保种管，冻存于-80℃冰箱。六、文库菌保存和文库筛选冻存于-80℃冰箱内，可以保存2年以上，文库质粒可以直接用于酵母文库筛选，pGADT7酵母双杂交文库菌的抗性为氨苄抗性（50ug/mL）
备注：1. 文库构建使用的引物序列，双杂交文库扩增检测引物：F：5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGAGCGCCGCCATG-3′R：5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′如果需要对文库中的克隆质粒进行测序，请使用以下引物：T7：TAATACGACTCACTATAGGGCADR：GTGAACTTGCGGGGTTTTTC
酵母双杂交文库筛选ORF1的相互作用蛋白服务案例
一、试剂、耗材（略）仪器设备（略）试剂及配制（略）二、诱饵载体构建pGBKT7-ORF1的构建与鉴定（此步骤为常规的实验方法，可以通过酶切、测序等方法鉴定酵母杂交诱饵载体正确性，此处略）三、ORF1自激活检测3.1酵母转化反应将各种质粒转入受体菌AH中，观察检测结果。
3.2酵母转化方法1.从YPDA平板挑取AH单菌落接种于YPDA液体培养基4ml，30℃，rpm，振荡培养18-20h（过夜），至OD.5，一般为4左右。2.转接YPDA液体培养基，培养体积为50ml，使初始OD=0.2，30℃，rpm，振荡培养4-5h，至OD=0.6。3.离心收菌，室温，rpm，5min。4.用20ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，rpm，5min，弃上清。5.用5ml0.1MLiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，rpm，5min，弃上清。6.用ul0.1MLiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5ml离心管，每个50ul（每个转化），备用。7.每个1.5ml离心管中依次加入相应试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1min左右，至完全混匀。8.30℃水浴孵育，30min。9.42℃水浴热激，25min。10.30℃水浴复苏，30min。11.离心收菌，室温，rpm，5min，弃上清。12.每个转化用ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板。13.30℃恒温培养4天。3.3ORF1自激活检测结果pGBKT7-ORF1+pGADT7共转化AH长出的酵母转化子随机挑取了6个菌落进行自激活检测。包括HIS3、ADE2和LacZ共3个报告基因的检测。HIS3和ADE2的检测采用点板培养的方法，将转化子点板至SD-TLHA平板，30℃恒温培养4天，观察其生长状态。LacZ报告基因的检测方法如下：1.从转化平板随机挑取6个菌落于滤纸片上。2.将滤纸完全浸于液氮中90s，取出常温放置2min晾干。3.在培养皿中加入新鲜配制的显色液，一般9cm培养皿用2-3ml显色液。4.将显色液加入培养皿中，再放入一张干净的滤纸，让其完全浸湿，将冻溶后的滤纸放在最上面，使显色液浸透表层，盖上皿盖。30℃避光培养，20min后开始观察，一般2h后可开始看到颜色变化。4-5h拍照记录结果。
对照菌株在SD-TL缺陷平板上都能正常生长，而仅有阳性对照可在SD-TLHA缺陷平板生长。pGBKT7-ORF1+pGADT7转化子中随机挑选的6个菌落在SD-TLHA缺陷平板上不能生长，生长状态同阴性对照，LacZ检测中结果也与阴性对照相同，因此不存在自激活。
自激活检测结论：ORF1诱饵克隆没有自激活作用。
四、文库筛选用含有正确pGBKT7-ORF1诱饵质粒的AH酵母转化子作为受体菌制备感受态，将文库质粒pGADT7-酵母双杂-cDNA转入其中，涂SD-Trp-Leu-His+5mM3AT平板。
五、影印清除为了消除背景生长菌落的干扰，在培养到第3天时，用绒布对筛库平板进行影印清除后，继续培养7-14天。分批挑取再次长出的转化子菌落进行下一步检测。六、阳性克隆鉴定至影印清除后继续培养7-14天，从筛库平板中挑取长出的阳性克隆单菌落，共挑取到20个初始阳性克隆转化子转接到SD-TL缺陷型平板中继续培养2-3天。6.1阳性克隆His和Ade报告基因的检测将上述SD-TL缺陷型平板上长出的20个初始阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点种至SD-TL和SD-TLHA缺陷平板，30℃恒温培养3-4天，结果如下图所示：
阳性克隆检测结果显示：在20个初始阳性克隆中，有13个能在SD-TLHA生长的是激活了ADE2和HIS3报告基因。
6.2阳性克隆LacZ报告基因检测将20个初始阳性克隆用无菌水重悬后点于滤纸片上进行LacZ报告基因检测。结果如下图所示：
七、酵母阳性克隆DNA提取和测序比对通过测序比对，可以将重复的阳性给克隆子去除，本实验案例中，有多个克隆子为重复的阳性克隆，经过筛除后，我们可以确认获得了6个完全不同的阳性克隆子。
八、回转验证用含有正确pGBKT7-ORF1诱饵质粒的AH酵母转化子作为受体菌制备感受态，将6种阳性克隆质粒DNA分别转化其中，分别回转验证His和Ade报告基因的检测和LacZ报告基因检测。
实验结论：
本项目以ORF1基因cDNA克隆为诱饵，筛选cDNA酵母双杂交文库，在筛选到的20个初始阳性中，经过鉴定结果显示有13个能激活ADE2、HIS3和LacZ报告基因。经过对这些阳性克隆质粒进行DNA测序和BLAST比对分析，结果表明它们分别属于6种不同蛋白的编码基因。通过对这6种阳性克隆的回转验证检测，结果显示所有阳性克隆都能通过对ADE2、HIS3和LacZ报告基因的回转验证。
