学者原创136开拓慢性丙型肝炎病毒感染的

年拉斯克临床医学研究奖授予了RalfBartenschlager，CharlesRice和MichaelSofia，他们在丙型肝炎的‘复制子’系统及其药物研发取得突破性进展，为万丙型肝炎病毒感染者提供安全有效的治疗方法所做出的开拓创举。肝脏在体内能源平衡中起着重要作用，产生必要的血浆蛋白，调节解毒和排泄代谢产物。因此，失去肝脏的功能在几天内就会致命。尽管肝脏具有强大的再生能力，持续的损害会导致慢性疾病，导致肝细胞纤维化，这导致静脉压力高、血液通过食管静脉会导致静脉曲张容易发生破裂，以及腹腔积液形成腹水。此外，肝脏失去代谢物解毒功能会导致脑部疾病。晚期肝病的起因和影响晚期肝病(ESLD)的主要原因是感染乙肝病毒、丙型肝炎病毒或过量饮酒。ESLD每年导致全球人死亡，仅在美国每年就导致40亿美元的医疗保健支出和亿美元的生产率和生活质量方面的损失。年度拉斯克临床奖授予了ThomasStarzl和RoyCalne，认可了他们对肝移植的贡献，即肝移植在合适的病人身上可以恢复肝脏功能。在二十世纪70年代，甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒毒被确认。血清学检测使乙肝病毒从输血产品中消除，乙肝疫苗预防感染是高度有效的。巴布隆伯格因对乙型肝炎的杰出研究，他在年获得诺贝尔奖、在年他和MauriceHilleman因对乙肝疫苗的发展做的贡献而获得拉斯科公共服务奖。丙型肝炎病毒的发现及其患病率血清学检测显示，甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒一起共导致了50%的病毒性肝炎，非甲非乙型肝炎患者的血浆经过一个精细的过滤器后依然可以传播肝炎到黑猩猩身上。在年，属于黄病毒属的包膜正链RNA病毒构的丙型肝炎病毒(HCV)被确定。丙型肝炎病毒有一个单一的开放阅读框，编码个氨基酸的蛋白，这种前体蛋白主要是加工生产十种成熟蛋白，包括伴结构蛋白、远端蛋白和前体蛋白质的加工和复制所需要的蛋白。丙型肝炎病毒的发现为慢性感染筛查的发展提供了可能，阻止了丙型肝炎病毒从输血产品中的传播，全球有1.7亿的丙型肝炎病毒感染者，其中包括万名美国感染者，每年引起人死亡。丙型肝炎病毒主要是通过静脉注射毒品、重复使用针头传播。急性感染后，通常无症状，75%-85%感染者发展为慢性感染者，在20-30年内，20%-30%的患者发展为肝硬化，一旦形成了肝硬化，每年1%-5%的病人发展为肝代谢失调(腹水、静脉曲张的出血和/或肝性脑病)、肝癌。在美国，丙型肝炎病毒是最常见的导致肝移植和肝癌的原因，丙肝每年引起万人死亡，比1型艾滋病相比每年造成更多死亡(人)。凯龙公司的MichaelHoughto和国家卫生研究院的HarveyAlter因发现丙型肝炎病毒的新发现而获得年的拉斯克临床医学研究奖。丙型肝炎病毒预防和治疗的挑战因为丙型肝炎病毒高度异构，包括六个主要基因型(1-6)、众多亚型(如1a、1b等)和变异株，因此还未能成功开发一种有效的丙型肝炎病毒疫苗。基因型1是最普遍，非基因型1丙型肝炎病毒共同引起了一半以上的慢性丙肝。疫苗的适用范围是一个挑战，因为一个人自发清除丙型肝炎病毒感染后依然可以被再次感染。很明显目前的高负担被感染者将发展为肝衰竭，所以发展有效的疗法的动力是很大的。最初的治疗方案并不是专门针对丙型肝炎病毒感染。年，美国食品和药品管理局(FDA)批准使用a干扰素，只有5%–10%的患者产生持续的病毒学反应(SVR，治疗12周后没有检测到病毒，临床表现为治愈)。利巴韦林、一个针对许多RNA和DNA病毒感染治疗的鸟嘌呤核苷，在48周的治疗后40%的患者被治愈，于年得到FDA批准。不幸的是，这种治疗方案由于明显的副作用是不容忍的，如流感样症状、抑郁和骨髓抑制，需要减少剂量或停用药物。此外，治疗需要根据特定的病毒和宿主基因型。尽管存在这些局限性，治愈的患者显示该疗法可以明显降低肝衰竭、减少肝移植，和死亡的进度，为开发改进的治疗方法提供强劲动力。亚基因组丙型肝炎病毒复制子的发展开发专门针对丙型肝炎病毒基因产物的抗病毒药物大大阻碍了病毒的传播或丙型肝炎病毒基因组在细胞中的复制，这种药物需要在黑猩猩和人类身上做测试。突破克服这种限制的是两个今年的拉斯克医学奖获奖者，洛克菲勒大学的查尔斯·赖斯和海德堡大学的RalfBartenschlager。考虑到缺乏传染性完整的丙型肝炎病毒基因组，赖斯指出，报告的病毒基因组3’末端异常短暂，而且缺乏参与相关病毒复制结构的特点。他的团队从被感染的病人纯化出病毒RNA，在寡核苷酸3’末端打结，并使用互补的引物合成互补的脱氧核糖核苷酸链，其次是PCR扩增病毒的完整3’末端。结果发现了在丙型肝炎病毒3’末端的以前未知的98个碱基序列，包括一个在最后50个碱基序列里的发夹结构。此外，这个序列在不同基因型HCV中是高度保守的，支持其重要的功能。千叶科技研究所的KunitadaShimotohno也获得了类似的结果。Rice和他的同事展示了完整的丙型肝炎病毒转录合成，当病毒注入黑猩猩的肝脏，形成肝炎，产生含有病毒RNA的血清编码的RNA和具有感染性的RNA结构一样。这证明了丙型肝炎病毒可以产生肝炎并激活产生强感染力HCV细胞培养模型。建立在这些研究基础上，Bartenschlager和他的同事们将以前使用的方法利用牛腹泻病毒制备出了丙型肝炎病毒基因组的片段，她不包含编码结构蛋白N端的基因，但包含一个可选的标记与病毒依赖RNA的RNA聚合酶、病毒蛋白酶和NS5A蛋白。一个肝癌细胞株引入这些亚基因组结构展示了他们的复制，尽管只有十万分之一细胞有病毒复制，这表明宿主细胞因子抑制复制。Rice实验室的后续研究是由不同基因型的HCV产生类似的亚基因组复制子。在这个巧妙的扩展实验中，他们用于表达分离克隆的细胞选择带有标记的细胞并测序复制的病毒RNA。他们发现9个独立的克隆的突变聚集在一个长30个密码子的NS5A病毒基因片段中的密码子段，还发现下游段的一个47个氨基酸片段的NS5A所需的抑制病毒复制的能力的干扰素的缺失。他们推断，NS5A在病毒复制过程中发挥作用，通过影响NS5A宿主基因产物抑制复制。重要的是，通过将NS5A突变引入亚基因组复制子，他们极大地增加了细胞支持病毒RNA复制的百分数，达到了10%以上。这些亚基因组复制子在详细研究丙型肝炎病毒生物学的各个方面非常有用。更关键的是，他们首次提供了基于细胞的重要基质来筛查有效抑制丙型肝炎病毒复制的抑制剂，为药物开发的提供了宝贵的财富。开发直接的抗病毒药物和制剂第一个专门针对特定的丙型肝炎病毒基因产物的药物是病毒蛋白酶抑制剂(NS3-4A)即boceprevir和telaprevir，于年获得FDA的批准。结合干扰素和利巴韦林使用24-48周，病毒基因型2和3感染者使用这些抑制剂，治愈率上升到50%-80%，但基因型1不太成功。在吉利德工作的迈克尔·索菲亚发现了sofosbuvir，他由于发现该药而获得今年的拉斯克奖。他的团队注意到之前的工作证明尿苷模拟显示没有抑制丙型肝炎病毒复制，然而其5’三磷酸是一个强有力的抑制剂。他们设计了一个聪明的策略就是使用药物前体，这个方法首先由卡迪夫大学的ChrisMcGuigan自主开发。McGuigan发现基因组5’端磷酸核苷，通常对于细胞是高度不通透的，当磷酸膜是不带电的时候可以穿过细胞膜。进入细胞，某些衍生品代谢成磷酸核苷。索菲亚和他的同事们开发了一种氨基磷酸酯前体药物，是5’磷酸衍生物b-D-20-deoxy-20-R-fluoro-20-b-C甲基尿苷进入肝细胞形成磷酸代谢衍生物，然后由宿主细胞将其磷酸化形成有效的三磷酸抑制剂，这种化合物是丙型肝炎病毒在细胞中复制的亚微摩尔抑制剂，体内使用可以在肝脏内产生高水平的三磷酸衍生物。在早期阶段的临床试验中显示sofosbuvir结合干扰素和利巴韦林可以表现出有效的抗病毒活性。吉利德已经成功开发多种药物治疗hiv-1感染，并正在为丙型肝炎病毒寻求变革治疗。他们看到sofosbuvir作为一个潜在的联合治疗的关键药物，于是在年以惊人的亿美元的价格从Pharmasset购买该药，尽管当时还没有成功完成三期临床试验。后续关键试验表明，sofosbuvir结合干扰素和利巴韦林来治疗基因型1和基因型4的HCV患者，sofosbuvir联合利巴韦林对基因型2和3的患者进行为期12-24周的治疗方案，治愈率可以上升到80%-95%。这些治疗获得FDA批准，年代表一个舍弃干扰素和利巴韦林治疗方案的重大进步。下一个直接抗HCV的药物来自百时美施贵宝的高敏和他的同事们，他们使用亚基因组复制子在一个简洁普通的屏幕里识别丙型肝炎病毒复制的新抑制剂。他们发现了daclatasvir，一种前所未有的点复制子体系的抑制剂还可以抑制丙肝全长病毒复制，在日本国家传染病研究所的TakajiWakita通过测序耐药病毒的复制子，他们发现电阻突变聚集在NS5A的氨基端个氨基酸范围内，之前赖斯发现NS5A突变促进病毒RNA复制预示着这是药物作用的靶标。他们还演示了NS5A抑制剂结合NS5B抑制剂或者蛋白酶抑制剂或干扰素和利巴韦林这些添加剂时的协同效应，基因型1丙型肝炎病毒感染者单剂量口服10毫克后，结果病毒载量降低一千倍。这个发现强调了无偏筛查所需表型的价值，但目前对NS5A的正常的生化功能仍然知之甚少。Daclatasvirpi







































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